Осп плита расшифровка: расшифровка, виды, состав и характеристики материала.
Что такое ОСБ (OSB).Виды и характеристики
Современные производители очень часто используют понятие ОСБ, указывая на материалы своей продукции. Однако многие люди не совсем разбираются, что же скрывается за этой аббревиатурой. Давайте более подробно рассмотрим, как расшифровывается ОСБ, на какие виды делится материал и в чем заключается главное его преимущество.
Сама аббревиатура ОСБ расшифровывается с английского языка как orient strand board. Если переводить на русский, то материал будет называться ориентировано-стружечная плита (или ОСП). Подобная продукция представляется в виде плит, листов или панелей. Производится она из небольших и плоских остатков древесины (это может быть щепа или стружка). Наиболее востребованным материалом являются хвойные породы деревьев. Однако некоторые производители активно используют тополь и осину.
Чтобы соединить стружку между собой, используются составы на основе смолы, воска, карбамида и других подобных веществ. Однако не переживайте, концентрация смолы в панелях минимальна (не более 10%) поэтому вы можете не переживать за то, что ОСБ может испарять вредные вещества и наносить вред вашему здоровью.
Применяется подобный материал преимущественно при строительстве домов. При покрытии лаком или ламинировании ОСБ панели могут прослужить несколько десятков лет.
На какие виды делится ОСБ плита?
Сегодня производители выделяют несколько категорий ОСБ плит. Выбирать тот или иной вариант необходимо, исходя из целей покупки панели. Итак, если говорить о способах использования, выделяют такие ориентированно стружечные плиты:
- ОСБ -1. Идеально подходит для использования в помещениях или климате с повышенным уровнем влажности.
- ОСБ -2. Как правило, используется для возведения несущих стен. Подобные плиты не переносят влажный воздух, поэтому устанавливаются в идеально сухих зданиях.
- ОСБ -3 сочетает в себе характеристики первых двух видов. Может использоваться для возведения несущих конструкций даже в условиях сильно повышенной влажности.
- ОСБ -4. Наиболее прочные плиты, которые могут выдержать даже самую сильную нагрузку. Они не боятся сильной влажности и могут использоваться для возведения несущих конструкций.
По дополнительной обработке плит выделяют такие категории ОСБ:
- Поверхности, покрытые лаком. Лак чаще всего используют на одной стороне. Такой прием позволяет придать плите большей долговечности.
- Ламинированные панели. Такие плиты покрываются ламинатом и могут выдерживать еще большую нагрузку.
- Шпунтованные модели. Специально обработанные панели, имеющие торцы с 2 или 4 сторон.
Преимущества ОСБ панелей
Широкое распространение ориентированно-стружечная плита получила благодаря огромному количеству положительных качеств:
- Повышенная прочность материала.
- Возможность дополнительного укрепления кровли и стен дома.
- Влагоустойчивость.
- Простота в установке.
- Привлекательный внешний вид, который позволяет использовать ОСБ в отделке здания.
- Экологичность.
- Небольшой вес плит, позволяющий быстро транспортировать и легко укладывать панели.
Некоторые люди переживают, что ОСБ может выделять формальдегид, который наносит вред здоровью человека. Однако это является мифом. Современные производители внимательно относятся ко всем нормам и изготавливает ОСБ по всем международным стандартам качества. Таким образом вы можете быть абсолютно уверены в том, что плита не нанесет вреда вашему здоровью.
Кроме того, на ОСБ наносят грунтовку или краску. Так плита полностью закупоривается, и никакой даже самый низкий процент вредных веществ не начнет выделяться в помещение.
Сфера применения ориентированно стружечных плит
ОСБ активно используется во многих сферах жизни. Однако чаще всего подобный материал применяют для:
- отделки стен;
- оформления кровли;
- установки чернового пола;
- возведения перекрытия;
- установки однослойного пола;
- изготовления сэндвич-панелей.
Такое широкое применение материала обусловлено тем, что он может выдержать даже самые высокие нагрузки. Все вышеперечисленные качества способствовали тому, что ОСБ сегодня стоит в одном ряду с такими отделочными материалами, как ДСП, МДФ, фанера и т.д.
Что лучше ОСБ или фанера?
Чаще всего ориентированно-стружечную плиту сравнивают именно с фанерой. Это объясняется тем, что материалы имеют много схожих свойств и качеств. Поэтому, если вы стоите на распутье и не знаете, какую плиту выбрать для отделки дома, обратите внимание на такие аспекты:
Стоимость ОСБ гораздо ниже, чем фанеры. Это объясняется тем, что на изготовление ориентированно стружечных плит идет сырье от быстрорастущих пород деревьев. В то время как фанера требует более дорогих пород.
- ОСБ не поддается расслаиванию даже по истечению нескольких лет.
- Прочность ориентировано-стружечной плиты гораздо выше, чем у фанерных панелей.
- Фанера очень сильно зависит от влажности. Из-за этого она быстро теряет свой внешний вид и функциональные свойства. В то время, как многие категории ОСБ могут выдержать даже самую высокую влажность.
- ОСБ лучше по соотношению категорий веса и прочности материала. Фанера немного тяжелее ориентировано-стружечных плит и менее выносливая.
Как видите, ОСБ является отличным конкурентом наиболее распространенным отделочным материалам. Вы можете смело использовать его при возведении зданий и ремонте в помещении. Главное – выбрать наиболее качественный вариант, который прослужит как можно дольше.
ОСП — это… Что такое ОСП?
ОСПОбъединённый совет предпринимателей
Беларусь
оценка стоимости предприятия
организация
ОСПорганосиликатное покрытие
Источник: http://www.tdzm.ru/science/technol.php
ОСПориентированно-стружечная плита
ОСПобразцы собственного производства
ОСПобластной сборный пункт
ОСПотношение сигнал/помеха
в передаче данных
ОСПотдел по связям с промышленностью
связь
ОСПоптическая система посадки
физ.
ОСП«Очень смешная передача»
«ОСП-Студия», телеканал ТВ-6
ОСПотделение связи с пехотой
воен., истор., связь
Словарь: Словарь сокращений и аббревиатур армии и спецслужб. Сост. А. А. Щелоков. — М.: ООО «Издательство АСТ», ЗАО «Издательский дом Гелеос», 2003. — 318 с.
обособленное структурное подразделение
ОСПОбъединённая социалистическая партия
в ряде стран
полит.
ОСПосновные санитарные правила
Словари: Словарь сокращений и аббревиатур армии и спецслужб. Сост. А. А. Щелоков. — М.: ООО «Издательство АСТ», ЗАО «Издательский дом Гелеос», 2003. — 318 с., С. Фадеев. Словарь сокращений современного русского языка. — С.-Пб.: Политехника, 1997. — 527 с.
ОСПобщая система преференций
Словарь: С. Фадеев. Словарь сокращений современного русского языка. — С.-Пб.: Политехника, 1997. — 527 с. ОСПобщая сельскохозяйственная политика
полит.
Словарь: С. Фадеев. Словарь сокращений современного русского языка. — С.-Пб.: Политехника, 1997. — 527 с.
ОСПоткрытый секторный прицел
для стрелкового оружия
Словарь: Словарь сокращений и аббревиатур армии и спецслужб. Сост. А. А. Щелоков. — М.: ООО «Издательство АСТ», ЗАО «Издательский дом Гелеос», 2003. — 318 с.
ОСПоборудование слепой посадки
авиа
Словари: Словарь сокращений и аббревиатур армии и спецслужб. Сост. А. А. Щелоков. — М.: ООО «Издательство АСТ», ЗАО «Издательский дом Гелеос», 2003. — 318 с., С. Фадеев. Словарь сокращений современного русского языка. — С.-Пб.: Политехника, 1997. — 527 с.
- ОССПб
- ОСП
Объединение строителей Санкт-Петербурга;
Объединение строителей Петербурга
СРО НП
http://sros.spb.ru/
организация, Санкт-Петербург, строительство
- ОСП
- ОСП-
огнетушитель самосрабатывающий порошковый
в маркировке
- ОСП
Источник: http://www.0-1.ru/handbook/showdoc.asp?dp=281
- ОСП-
Пример использования
ОСП-01
ОСПокружность средней части плеча
используется Всемирной организацией здравоохранения при оценке питательного статуса грудных детей
мед.
Источник: http://www.who.int/childgrowth/ru/
ОСПотдельное самостоятельное подразделение
Источник: http://timer.dp.ua/databank/ukraine/abbr.htm
ОСПотдел судебных приставов
Источник: http://www.tia-ostrova.ru/node/35143
- ОСП
- ОСП УР
Общественный совет пенсионеров Удмуртской Республики
организация, Удмуртия
- ОСП
Источник: http://www.regnum.ru/news/686360.html
ОСПоборудование системы посадки
Источник: http://www.lawlink.ru/library/?section=443&pageID=124
ОСПорганизация строительного производства
кафедра НГАСУ
образование и наука
Источник: http://www.ngasu.nsk.su/caf.html
ОСПотдел стратегического планирования
Источник: http://www.prior.ru/media/
Словарь сокращений и аббревиатур. Академик. 2015.
Плиты ОСП: виды и характеристика
16.12.2014
Плиты ОСП появились на российском строительном рынке довольно давно, но по сей день существует не совсем верное представление об этом стройматериале. Зачастую встречая в магазине ценник ОСП-3 9 мм, до конца не понимая, что это такое, покупатель считает, что это та же советская ДСП лишь в другой обертке. Подобное родство омрачает репутацию ОСП, в связи с тем, что советская древесно-стружечная плита не отличалась высокими эксплуатационными качествами и была склонна к выделению вредных для здоровья паров формальдегида. Но сходство между ними велико лишь на первый взгляд.
Что такое ОСП?
ОСП (от английского OSB — oriented strand board) – аббревиатура, означающая термин «ориентированно-стружечная плита» — конструкционный строительный материал, выпускаемый в форме прямоугольных плит стандартных параметров. Сырьем для производства ОСП плит является крупноразмерная стружка из сосны, реже осины. В единый массив щепа склеивается водостойкой смолой с модифицирующими наполнителями и отвердителями в условиях автоклавных установок. Под воздействием высокой температуры и давления частички склеиваются и затвердевают.
Классификация плит ОСП
Кроме ОСП-3 есть ориентировано-стружечные плиты с маркировкой ОСП-1 и ОСП-2. Главное различие – прочность и гидростойкость. В сложных условиях повышенной влажности либо большой механической нагрузки рекомендуется использовать плиты с маркировкой OSB-3. Они отличаются лучшими эксплуатационными характеристиками. Поэтому их стоимость исключительно высокая по сравнению с ОСП-1 и ОСП-2. Несмотря на то, что ОСП-2 достаточно прочная, чтобы выдержать несущую нагрузку, приходящуюся на стены здания, ее влагостойкость оставляет желать лучшего. Поэтому использование их в домостроение рекомендуется лишь в условиях пониженной влажности. ОСБ-1 помимо низко устойчивости к влаге, также не отличается прочностью, в связи с чем, ее использование в строительстве ограничено. Она широко применяется в мебельном производстве, а также для изготовления упаковки и обшивки.
ОСП и ДСП: в чем различия?
Между плитами ОСП и ДСП есть два существенных различия, которые оказывают решающее значение на их качество и разводят их в разные стороны.
Во-первых, структуры плит. В том и другом случае основным сырьем для их изготовления является древесная щепа. В случае с ОСП она значительно больше и достигает в ширину 1-1,2 см и длину 7,5-15 см. Но основное отличие – ориентация цепы. Листы ОСП складываются из трех, реже четырех, спрессованных стружек. Щепа во внешних слоях листа располагается продольно, во внутреннем – поперечно.
Второе различие в технологии производства. Затвердевание плит ДСП происходит под прессом и при высокой температуре. Плиты ОСП становятся жесткими в результате природного процесса полимеризации смол, который длится несколько месяцев. В этом заключается качественное различие между видами стройматериалов: опасность выделения ядовитых паров формальдегида. И в том, и в другом случае в качестве связующего вещества используют смолы, для которых характерно данное явление. К слову, формальдегид выделяется даже из натурального дерева, только в очень маленьких концентрациях, не опасных для человека и животных. В ходе продолжительного затвердевания плит ОСП происходит естественное выделение формальдегида. К моменту его использования по назначению концентрация испарений снижается до предельно допустимых значений 0,1 ppm.
Эксплуатационные характеристики ОСП
- Форма и размер. Все плиты ОСП выпускаются в форме прямоугольных плит стандартных размеров с одним отличием: с ровными краями и со шпунтом.
- Простая обработка. Для работы с плитами ОСП не требуются сложные столярные инструменты. Плиты легко поддаются сверлению, шлифовке, распилу с помощью обычной ножовки, пилы и сверла.
- Высокая степень удержания. Невзирая на условную тонкость листов, большеразмерная щепа в их составе удерживает гвозди и шурупы без сколов и трещин. Крепеж можно устанавливать от края вплоть до 6 мм.
- Подходит для любой финишной отделки. Можно использовать различные клеевые составы и лакокрасочные вещества. Ровную и гладкую поверхность плит достаточно обработать наждачной бумагой.
- Требуется дополнительная защита от влаги. Даже самые гидростойкие плиты ОСП-3, рассчитанные на влажность до 65 %, снаружи рекомендуются покрывать водоизоляционными составами.
- Не помешает дополнительная огнезащита. Как не крути ОСП это дерево, которое имеет V класс пожарной угрозы стройматериалов.
- Безопасно для людей и окружающей среды. Панели ОСП, так же, как и дерево, относятся к классу экологической безопасности Е1.
Фотогалерея
характеристики, фото, область применения, виды и размеры
В последнее время, среди стройматериалов, набирают популярность стружечные плиты OSB (на русский язык аббревиатура переводится как «ориентировано — стружечная плита», хотя отечественные производители и продавцы используют термин ОСБ).
Виды и области применения OSB (ОСБ) плит
Существует несколько разновидностей стружечных плит. Каждому виду присущи определенные характеристики, следовательно, и области применения будут разнообразны.
OSB1 – имеют низкую плотность материала, при контакте с влагой, материалу наносится серьезный ущерб. Такие плиты зачастую используют в мебельной отрасли.
OSB2 – прочность и плотность материала, больше чем OSB1, но все также нежелательно присутствие влажной среды. Применяются как материал для обшивки помещений с небольшим уровнем влажности.
OSB3 – характеризуется влагостойкостью и высокой прочностью, однако при постоянном контакте с водой возможна деформация. Данную плиту можно использовать снаружи помещения, предварительно обработав. Благодаря соотношению цена — качество получила широкое распространение.
OSB4 – обладает самой большой прочностью и влагостойкостью. Вода или влажность не наносят вреда, даже при постоянном взаимодействии. Несмотря на все прекрасные качества, имеется один минус — это цена, которая значительно выше стоимости OSB3.
Класс | Прочность | Влагостойкость |
---|---|---|
OSB 1 | Низкая | Низкая |
OSB 2 | Высокая | Низкая |
OSB 3 | Высокая | Высокая |
OSB 4 | Сверхвысокая | Высокая |
Габариты OSB (ОСБ)Еще одним важным критерием OSB является толщина плиты. Длинна и ширина всегда остаются постоянными — 2500х1250 мм, в то время как толщина может изменяться от 8 до 26мм, с интервалом в 2 мм.
В современном строительстве домов, часто используют ОСБ плиты как основной материал.
Если предполагается использовать OSB для обшивки стен, или укрепления деревянного пола, то есть когда не нужна повышенная прочность, подойдет плита толщиной до 16мм.
Если же плита будет находиться под существенной постоянной нагрузкой, рекомендуется применять OSB толщиной от 16 мм. Зачастую применяется для создания основы под тяжеловесные предметы, или для кровельных конструкций.
Таблица размеров OSB (ОСБ) плит
Показатели | Плиты с ровными краями | Плиты со шпунтом | ||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Размеры (ДхШ), мм | 2440х1220, 2500х1250 | 2440х1220, 2440х590, 2450х590, 2500х1250 | ||||||||||
Толщина, мм | 9 | 10 | 11 | 12 | 15 | 16 | 18 | 22 | 15 | 16 | 18 | 22 |
Количество листов в пакете, шт. | 100 | 80 | 75 | 70 | 55 | 50 | 45 | 35 | 55 | 50 | 45 | 35 |
Основные свойства плиты OSB (ОСБ)
Плиты OSB являются незаменимым и широко распространенным материалом при строительных работах. Ниже представлен список основных полезных свойств данного материала:
- выдерживает большой вес, благодаря высокой прочностью;
- легкость и упругость листа позволяет использовать OSB при обшивке неровных поверхностей;
- однородность материала обеспечивает целостность при сгибании, в отличие от фанеры, которая при сгибании расслаивается;
- в отличие от древесины, при высокой влажности, OSB меньше подвержена появлению дефектов;
- легкая обработка инструментами позволяет быстро скреплять листы;
- обладает высокой теплоизоляцией, и одновременно звукоизоляцией;
- материал устойчив к химическим и механическим воздействиям;
- не склонен к образованию плесени и грибка;
Применение OSB (ОСБ) плит
Благодаря отличным свойствам ориентировано стружечных плит, их можно применять во многих сферах строительных работ.
При монтаже полов. Поверхность плиты OSB имеет гладкую и ровную поверхность, также она подходит по прочности для этих целей. Их можно укладывать на бетонную стяжку, под ламинат или линолеум, или в качестве пола над грунтом на даче.
Для внешних стен. Из OSB-3 панелей можно построить сарай или временную жилую постройку. Но следует помнить, что поверхность панелей нужно грунтовать, а кромки заполнить герметиком.
ОСБ плиты можно использовать не только для возведения пристроек. Из них получаются отличные полноценные загородные дома, которые нужно лишь утеплить с помощью дополнительных материалов.
Для внутренних стен. В зависимости от влажности в помещении можно использовать OSB-2 либо OSB-3. Если применяется более влагостойкая панель, ее можно обработать красками на водной основе, что обеспечит лучшему пропусканию пара, сохраняя микроклимат.
Для строительства домов из сэндвич-панелей. OSB используется в готовых блоках для быстрого строительства дома по современной технологии.
Еще одним плюсом OSB является простота крепления, они просто закрепляются на каркасе с помощью саморезов. Для монтажа пола используются специальные лаги, опорой для кровли делается деревянная обрешетка, а для обшивки стены устанавливаются металлические профили. Интервал при установке этих сооружений не должен быть больше 400 мм.
Из всего вышеперечисленного видно, что OSB плиты являются долговечным и недорогим материалом незаменим при любом ремонте или строительстве.
Видео: Как производят OSB плиты
Фото применения ОСБ плит в строительстве
Осб плита: характеристики и область применения
Покраска ОСБ плит
Данные изделия отлично переносят всевозможные виды отделочных работ. Эти плиты можно смело покрывать краской, наносить на них лак, штукатурить, делать обшивку с помощью кирпичной кладки и многое другое.
На изделия отлично наносятся клеевые массы и лакокрасочные растворы. Это даёт широкие возможности изменять плиты во внешнем виде и защитить их от воздействия влаги. По завершении работы над покраской плит можно покрыть изделие лаком, однако только при проведении внутренних работ, в случае наружных работ используют более серьезные методы.
Прежде, чем перейти к окраске плиты, поверхность нужно подготовить. Сначала нужно выполнить шлифовку с помощью наждачной бумаги. Это делается для того, чтобы грунтовка и краска не попали внутрь плиты. Затем рабочую зону в местах крепления нужно выровнять с помощью шпаклёвки. Высохшую шпаклёвку стоит зачистить шкуркой. После этого поверхность равномерно грунтуется акриловым или акрилово-полиуретановым водным лаком для дерева пропорцией 1:10. Можно для этого приобрести специальную грунтовку. Дальше плита окрашивается и сушится. При этом избегайте сквозняков и перепадов температур.
Ориентированно-стружечные плиты являются поистине качественным материалом современного строительства. Сейчас эти средства популярны в строительных работах, очень часто используются. На свою цену изделия действительно очень качественные и полностью её оправдывают. Среди тех людей, которые использовали данные плиты, практически не найдётся ни одного, который бы негативно о них отозвался. Листы ОСБ имеют огромное количество положительных характеристик, что делает их применение достаточно лёгким.
Для того, чтобы качественно облицевать объект с помощью этих плит, нужно с грамотностью подойти к их выбору, полностью изучить их разновидности и характеристики, чтобы потом не жалеть о покупке.
Эти листы считаются отличным решением для всех специалистов. Они позволяют создавать целые дома, используя технологию каркасов, идеальны для отделки стен, крыш, полов. Всё это делается с этими материалами в кратчайшее время. Жильё, выполненное с применением ОСБ плит, будет служить долговечно и обеспечит жильцам комфорт и уют.
Строительные компании, а также производители мебели часто указывают в качестве используемых материалов OSB плиты или просто OSB. Эта аббревиатура обычно ничего не говорит простому потребителю. Итак, OSB – что это такое, для чего используется, какие имеет достоинства или недостатки?
Название OSB расшифровывается просто – это начальные буквы слов orient strand board, которые переводятся как ориентировано-стружечная плита. Также плиты могут называть ОСБ панелями, осп листами или просто ОСБ или ОСП.
Плиты производятся из плоских древесных стружек или щепы. Для производства OSB плит больше всего подходит сырье из хвойных пород, но также используют и осину, тополь и т. д. В отличие от прочих стружечных плит (ДСП, к примеру), в ОСП щепа укладывается в заданном направлении. Именно поэтому такие стружечные плиты называются ориентированными. Поскольку ОСБ плиты состоят из нескольких (обычно из трех) слоев, направление стружки в слоях чередуется, благодаря чему эти плиты более прочные.
Для соединения щепы между собой используются смолы, состоящие из карбамида, меламина, восков и прочих веществ. Содержание смол в составе – менее 10%, что делает ОСБ панели условно-натуральным материалом. Панели могут ламинироваться или лакироваться для дополнительной защиты.
OSB плиты нашли широкое в домостроение. В частности, они являются частью , материала, использующегося для .
ОСБ плита – это листы размером примерно 2,5 на 1, 25 м. Толщина плит бывает разной, она варьируется от 6 до 38 мм. Для удобства монтажа плиты могут иметь обработанные торцы по принципу «паз-гребень».
Свойства и технические характеристики
Плиты ОСП конкурируют с другими листовыми материалами как в области строительства (для обшивки каркасов, создания опалубки), так и в области отделки (выравнивание стен, полов, потолков). Этому способствуют свойства ОСП:
- Прочность примерно такая же, как у фанеры и в 2,5 раза выше чем у ДСП.
- Высокая степень влагостойкости. По нормативам, водопоглощение при нахождении в воде в течении суток не больше 10%. Плита ОСП стала популярной благодаря своим свойствам
- Плиты OSB можно пилить, сверлить стандартным плотницким инструментом.
- Крепить можно шурупами, саморезами. Крепеж удерживается лучше чем в хвойной фанере и ДСП.
- Не повреждается грызунами, жуками.
- При нормальном качестве, пустоты, расслоения и другие дефекты встречаются редко.
Еще раз обращаем внимание, что влагостойкость и стойкость к деформациям свойственна ОСП, которые были сделаны с соблюдением технологии. К сожалению, материал российского производства не отличается высоким качеством
Используются менее мощные прессы, пытаются экономить на связующем, не наносят разметку. В результате есть много примеров негативного опыта: плиты от влаги разбухают, их коробит, клей вымывается… Выход — искать плиты импортного (Европа или США) производства. В связи с ростом доллара они сейчас имеют немалые цены, их очень мало на рынке, но, при желании, можно найти или заказать с доставкой.
Сравнение характеристик листовых строительных материалов
Ситуация усугубляется тем, что по внешнему виду отличить влагостойкий ОСП3 от невлагостойкого ОСП2 или 1 невозможно. Стоят последние намного меньше. Недобросовестные продавцы продают более дешевые под видом влагостойких. Вот и получаются неприятности. Как выход из положения можно поступить так: купить один лист ОСП 3, проверить его поведение при высокой влажности. Если видимых изменений нет, купить партию.
Применение OSB-плит
Ориентированно-стружечные плиты могут применяться как конструкционный или как отделочный материал. Благодаря своим уникальным свойствам, материал находит применения в следующих областях:
Облицовка стен.
Одно из первых исторических применений для ОСП – обшивка каркасных конструкций. Данный материал отлично справляется с этой задачей. Результатом такого практического приложения станет ровная поверхность стены, которая требует минимальной отделки
Внешние стены каркасника облицованы. Внутренние ожидают облицовкиИсточник stroydom64.ru
Видео описание
В данном видео наглядно показан процесс обшивки внешних стен каркасного дома OSB-плитой:
Благодаря большой площади листов можно быстро уложить бесшовный пол. ОСП может укладываться как на деревянные балки, так и на бетонное основание. В свободное пространство могут помещаться звуко- или теплоизолирующие материалы. На поверхность плит укладывается основное напольное покрытие, например, ламинат или плитка. Также такой пол может использоваться и без основного покрытия
Процесс укладки ОСП на балкиИсточник a.d-cd.net
Основа для кровли.
Высокие прочностные характеристики ОСП, позволяют плитам выдерживать снеговые и ветровые нагрузки. Это позволяет применить материал в качестве подложки для кровли.
Установка плит ведётся в шахматном порядкеИсточник factum.ru
Двутавровые балки для перекрытий.
Конструкции на основе плит могут создавать конструкционный объем в межэтажных и стеновых перекрытиях. Прочностные свойства ОСП обеспечивают жёсткость конструкции, отсутствие деформаций
Конструкции из ОСП образуют перекрытиеИсточник avantidom.ru
SIP-панели.
Structural insulated panel (SIP), или структурные изолированные панели (СИП), активно применяются в малоэтажном жилом строительстве. По своей сути панель – это композитный утепляющий материал. Он представляет собой два листа ОСП, между которыми размещён утеплитель. SIP-панели обладают высокими теплосберегающими свойствами, а также просты в монтаже
Структура SIP-панелиИсточник tildacdn.com
Видео описание
В этом видео рассказывается, какие типовые проекты домов могут быть построены с применением SIP-панелей:
Многоразовая опалубка.
ОСП может использоваться как материал для съёмной опалубки для ведения фундаментных работ. В случае таких приложений применяют либо ламинированные, либо шлифованные плиты
Многоразовая опалубкаИсточник толькопрофи.рф
Тароупаковка.
Низкая цена и запас прочности сделали данный листовой материал отличным решением для упаковки крупногабаритных грузов
Стенки ящиков выполнены из ОСПИсточник tcrllc.com
Мебель.
Использование ОСП для производства мебели – нестандартное решение. Однако, такая мебель выглядит оригинально и может стать украшением дизайнерского интерьера
Пример органичного использования в интерьереИсточник helblingfotografie.ch
Коротко о главном
Ориентированно-стружечную плиту по праву можно назвать универсальным древесным материалом. Появившись как материал для облицовки стен и фасадов, ОСП перекочевала и в иные сферы строительства и даже в столярное дело.
Секрет популярности ОСП кроется в её уникальных свойствах. Материал обладает высокими механическими и технологическими параметрами, малым весом, а главное – доступной ценой. Такие свойства обеспечиваются строением ОСП – склеенная в определённом порядке древесная щепа делает материал подходящим решением для многих задач.
Совокупность всех качеств материала позволило ему занять нишу на рынке, несмотря на свою недолгую 30-летнюю историю существования.
Размеры OSB плит
Стандартные размеры ОСБ листа составляют: 1250×2500 мм. по европейским стандартам и 1220×2440 мм. по североамериканским стандартам. Иногда в продаже можно встретить плиты длинной 3000 и 3150 мм. Некоторые производители, под заказ, выпускают плиты большей длинны, до 7 метров.
При выборе размера OSB плит лучше всего отдать предпочтение более крупным листам. Выбрав большие по размеру листы, вы получите меньше стыков после их монтажа
Это очень важно при обшивке некоторых конструкций. В качестве примера можно привести обшивку стен каркасного дома
В этом случае очень важно, чтобы одна плита закрывала всю высоту, от низа до верхнего этажа или крыши.
Толщина листов OSB варьируется от 6 до 25 мм. Выбор толщины зависит от следующих факторов:
- марки OSB;
- предполагаемых нагрузок;
- расстояния между опорами.
Размеры, вес и площадь листа ОСП популярных производителей
На отечественном рынке ориентировочно-стружечные плиты представлены продукцией российских и европейских компаний, среди которых наиболее узнаваемы бренды: Kronospan (Беларусь, Могилев), ДОК «Калевала» (РФ, Карелия), GLUNZ (Германия), EGGER (Румыния) и Ultralam (г. Торжок, РФ).
Kronospan
Kronospan — австрийский производитель древесных материалов, имеющий разветвленную сеть заводов по всему миру, включая Беларусь. ОСП могилевского предприятия отвечает европейским стандартам, но при этом отличается доступной ценой. Отменные эксплуатационные характеристики и повышенная влагостойкость сделали OSB марки Kronospan одним из лидеров продаж российского рынка стройматериалов.
Марка | Размеры листа, мм | Площадь листа м2 | Вес листа, кг |
---|---|---|---|
OSB-3 | 2500×1250×9 | 3.1 | 17.2 |
2500×1250×10 | 19.1 | ||
2500×1250×12 | 22.9 | ||
2800×1250×12 | 3.5 | 25.6 | |
2500×1250×15 | 3.1 | 28.6 | |
2500×1250×18 | 34.3 | ||
2500×1250×22 | 41.9 | ||
OSB-4 | 2440×1220×11 | 3 | 20.15 |
2500×1250×12 | 3.1 | 23.5 | |
2500×1250×15 | 29.4 |
ДОК «Калевала»
ДОК «Калевала» является крупнейшим изготовителем древесных плит в России. На предприятии внедрены новейшие технологии, что позволило наладить выпуск качественной и экологически чистой продукции, отвечающей наивысшим стандартам безопасности. Благодаря этим особенностям ОСП от ДОК «Калевала» завоевали популярность не только в РФ, но и в странах СНГ.
Марка | Размеры листа, мм | Площадь листа м2 | Вес листа, кг |
---|---|---|---|
OSB-3 | 2500×1250×8 | 3,1 | 15,5 |
2440×1220×9 | 3 | 16,6 | |
2500×1250×9 | 3,1 | 17,5 | |
2440×1220×12 | 3 | 22,2 | |
2500×1200×12 | 22,3 | ||
2500×1250×12 | 3,1 | 23,3 | |
2800×1250×12 | 3,5 | 26,1 | |
2500×1250×15 | 3,1 | 29,1 | |
2500×1250×18 | 34,9 | ||
2500×1250×22 | 42,6 | ||
2440×1220×22 | 3 | 42 | |
OSB-3 с 2-х сторонним паз-гребнем. | 2500×1250×12 | 3,1 | 23,3 |
1250×1250×12 | 1.6 | 11.7 | |
OSB-3 с 4-х сторонним паз-гребнем. | 2500×1250×12 | 3,1 | 23,3 |
OSB-3 Экодом | 2500×1250×9 | 17,5 | |
2500×1250×12 | 23,3 | ||
2800×1250×12 | 3,5 | 26,1 | |
OSB-3 Экодом с 2-х сторонним паз-гребнем. | 2500×1250×12 | 3,1 | 23,3 |
OSB-3 Экодом с 4-х сторонним паз-гребнем. | 2500×1250×12 |
GLUNZ
Немецкий бренд GLUNZ, по праву, считается флагманом отрасли ориентировочно-стружечных плит. Особенностью производителя является использование высококачественных лесоматериалов и экологически чистых клеящих составов. На предприятии выпускают OSB-3 с уровнем эмиссии формальдегида E0. Это делает ОСП GLUNZ абсолютно безопасными.
Марка | Размеры листа, мм | Площадь листа м2 | Вес листа, кг |
---|---|---|---|
OSB-3 | 2500×1250×6 | 3.1 | 12.2 |
2500×1250×9 | 18.3 | ||
2800×1250×9 | 3.5 | 21.9 | |
2500×1250×12 | 3.1 | 24 | |
2800×1250×12 | 3.5 | 28.8 | |
2500×1250×15 | 3.1 | 36 | |
2500×1250×18 | 54 | ||
2500×1250×22 | 24 | ||
OSB-4 | 2500×1250×9 | 12.2 | |
2500×1250×12 | 24 | ||
2800×1250×12 | 3.5 | 28.8 | |
2500×1250×15 | 3.1 | 36 | |
2500×1250×18 | |||
2500×1250×22 | 24 | ||
OSB-3, паз-гребень | 2800×675×12 | 1.9 | 13 |
2500×675×15 | 1.7 | 16.2 | |
2500×675×18 | |||
2500×675×22 | 23.8 |
EGGER
Европейский бренд, продукция которого считается эталонным образцом высокого качества при необычайно низкой цене. OSB этой марки, выпушенные румынским предприятием, обладают хорошей плотностью, идеальной геометрией и низкой гигроскопичностью, что делает их незаменимыми в строительстве и производстве мебели. Производитель выпускает плиты экологического стандарта E1 и E0.
Марка | Размеры листа, мм | Площадь листа м2 | Вес листа, кг |
---|---|---|---|
OSB-3 | 2500×1250×6 | 3.1 | 12 |
2500×1250×8 | 16 | ||
2500×1250×9 | 17.4 | ||
2500×1250×12 | 23.3 | ||
2500×1250×12 | 3.5 | 26 | |
2500×1250×15 | 3.1 | 28.1 | |
2500×1250×18 | 32.8 | ||
2500×1250×22 | 42.8 |
Ultralam
Марка | Размеры листа, мм | Площадь листа м2 | Вес листа, кг |
---|---|---|---|
OSB-3 паз-гребень | 2440×610×18 | 1.5 | 16.86 |
16.86 | |||
2485×610×18 | |||
2485×610×22 | 21 | ||
OSB-3 | 2500×1250×6 | 3.1 | 11.5 |
2500×1250×8 | 15.7 | ||
2440×1220×9 | 3 | 15.9 | |
2500×1250×9 | 3.1 | 16.7 | |
2500×1250×11 | 20.7 | ||
2500×1250×12 | 23 | ||
2800×1250×12 | 3.5 | ||
2500×1250×15 | 3.1 | 26 | |
2500×1250×18 | 31 | ||
2500×1250×22 | 38 |
Чистовая отделка поверх плит
Оформлять поверхности, обшитые ОСП, можно по-разному. Очень часто для отделки поверх таких плит используются:
красители;
гипсокартон;
керамическая плитка;
ламинат, ковровые покрытия, линолеум;
обои.
Окрашивать материал этого типа допускается как водоэмульсионными составами, так и акриловыми. Перед выполнением этой операции плиты рекомендуется грунтовать. Обрабатывать листы ОСП при необходимости допускается с использованием не только красителя, но и лака. Перед нанесением грунтовки такие плиты желательно дополнительно отшлифовать. Считается, что из акриловых красок для обработки ОСП лучше всего подходит “Нордика Эко” 3330-03. Самой же лучшей грунтовкой для этого материала считается ГФ-021.
Плитку крепить на ОСП стоит с использованием клеев, предназначенных для отделки кафелем древесины. Перед обшивкой полов из ОСП ламинатом, линолеумом или ковровым покрытием рекомендуется герметизировать все имеющиеся между листами щели силиконом.
Перед наклейкой обоев плиты ОСП так же, как и перед окрашиванием, обязательно должны быть прогрунтованы. Отшлифовать поверхность материала предварительно следует и в этом случае. В клей при отделке обоями рекомендуется добавлять немного ПВА. Это снизит содержание в нем воды и предотвратит разбухание плит в последующем.
ОСБ-плиты: уже вчерашний день?
Как известно, научно-технический прогресс неостановим. Вот и вместо привычных нам ОСБ-плит несколько лет назад на рынке появились новые древесно-стружечные QSB плиты.
Они состоят из одного слоя более мелких, специально отсортированных стружек, чем ОСБ. Такие плиты не прессуются, а динамически накатываются, подобно листовой стали. При этом достигается небывалая плотность (порядка 800-900 кг/м 3), тогда как плотность ОСБ2 и ОСБ3 находится в диапазоне 550- 650 кг/м 3 . Кроме того, QSB плиты имеют двустороннее покрытие гидрофобизатором.
По прочностным и влагозащитным характеристикам, а также ценовым показателям новый материал оказался примерно эквивалентным плитам ОСБ4. Поэтому сколько-нибудь заметного вытеснения с рынка всем привычных ОСБ3 с его появлением не произошло.
Последним словом в технологиях конструкционных древесных плит стали так называемые древесно-цементные плиты (например, марки Green Board). Основой их (до 60 % массы) являются узкие и длинные древесные ленты («древесная шерсть») и связующее вещество в виде высококачественного цемента. Такие плиты абсолютно негорючи и влагостойки.
Плиты ОСБ становятся с каждым днём всё более популярными. Что же такое ОСБ? Это ориентированно-стружечные плиты, которые делают с помощью стружки из дерева и опилок. Плиты очень прочные, гибкие, имеют отличные технологические характеристики. Их применяют в каркасных строительных работах для того, чтобы обшить стены, сделать кровлю или перегородки.
Выглядит данная плита как прессованное полотнище, которое создано из щепочек, стружек и различных опилок. Внимательно рассмотрев данное полотно, вы увидите, что оно включает в себе далеко не один слой. Слои, которые находятся снаружи, располагаются вдоль, а слои, которые находятся внутри – сделаны в другом направлении. Все слои отлично между собой проклеены с помощью различных смол, воска, пропитки, поэтому изделие само по себе очень прочное.
Мы рассмотрим, какие бывают плиты ОСБ, каким образом их применяют в строительстве, увидим все их достоинства, перечислим самые популярные виды плит.
Работы с внешними стенами
Используя при отделке внешних стен ОС листы, строим работу таким образом:
- Тщательно обрабатываем торцовые стороны. Плиты укладываем, оставляя небольшие зазоры. Полученные при этом швы заполняем с помощью акриловых герметиков.
- Наносим грунтовочную смесь. При необходимости пропитываем листы герметиком на водной основе. Затем просушиваем и зашлифовываем плоскость.
- Армируем стыки плит, а дальше укладываем фасадную штукатурку. Удобнее работать с эластичными составами.
- В завершении оформления внешних стен окрашиваем их. Покраска ОСБ плиты снаружи проводится акриловой или масляной основой.
Что представляет собой ОСП: состав, структура, особенности производства и разновидности
Внешне плиты ОСП заметно отличаются от МДФ и ДСП благодаря особенностям структуры. В производстве материала используется тонкая и длинная древесная щепа, которая в наружных слоях ориентируется продольно, а во внутренних слоях – поперечно. Даже в случаях, когда ориентация не слишком очевидна, ОСП можно распознать сразу по крупным, по сравнению с другими древесными плитами, спрессованным элементам. Длина стружки в плите составляет 75-150 мм, а ширина – 15-25 мм. Благодаря такой ориентации стружки, OSB плита приобрела свойства, которые значительно расширили области ее применения.
Оригинальное название материала – OSB (oriented strand board), что в переводе с английского и означает «ориентированно-стружечная плита. В России используют обе аббревиатуры – ОСП и OSB. В некоторых случаях можно услышать и сокращение ОСБ, что является ни чем иным как транслитерацией английской аббревиатуры.
ОСП производится методом прессования плоской древесной стружки смешанной со связующим материалом. Для этого используется специальное оборудование, в первую очередь – современные высокотехнологичные линии прессования. Крупные заводы в США и Европе используют ContiRoll – линии непрерывного прессования.
Процесс производства плит OSB последовательно проходит в несколько этапов:
1. Сортировка сырья. Сырьем для изготовления ориентировано-стружечной плиты служат лесоматериалы таких древесных пород как осина, ель, сосна и тополь. После доставки сырья к производственной линии производится тщательный отбор бревен.
2. Подготовка сырья и изготовление стружки. После сортировки производится механизированная окорка бревен. Далее очищенные бревна распиливаются на короткие заготовки и отправляются в строгальную установку, где расщепляются на стружку по направлению вдоль древесных волокон. В завершение этапа осуществляется сушка щепы конвейерным способом и ее сортировка.
3. Подготовка состава для прессования и формовка. В качестве связующего вещества для плит ОСП используется воск и клеящие составы на основе парафина, фенолформальдегидной либо изоцианатной смолы и борной кислоты, с которыми стружка смешивается поэтапно. Затем полученная смесь передается на формовочную станцию, где осуществляется ее раскатка и формовка в однородный ковер перед отправлением под пресс.
4. Прессование плит. Прессование плиты осуществляется под давлением 5N/мм2 и при температуре, необходимой для застывания смолы – 170-200 градусов. Температура и давление в зоне прессования постоянно контролируется. После прессования и обрезки кромок, материал подвергается контрольным замерам толщины и плотности, а также проверки на наличие дефектов, а затем выдерживается в течение 48 часов до окончательной полимеризации связующих составов.
5. Нарезка и упаковка. После контрольной проверки качества, OSB полотно раскраивается на элементы стандартного формата, кромки элементов профилируются, а полученные плиты отправляются на линию маркирования и упаковки.
Основные производители плит ОСП – Канада, Австрия, США, Прибалтика. Производственные линии OSB были открыты и в Китае, однако из-за не слишком высокого качества плит, китайская продукция не стала популярной. В период с 2012 по 2016 год было запущено производство ориентировано-стружечных плит и в России, где при должном качестве материала удалось добиться более низкой его стоимости.
Разновидности OSB плит
В зависимости от количественных и качественных параметров плиты OSB подразделяют на 4 класса.
- OSB-1. Из-за наиболее низкой, по сравнению с плитами других классов, влагостойкости может использоваться исключительно в сухих условиях в не нагруженных конструкциях.
- OSB-2. Материал используется для возведения конструкций, с оказанием на них несущей нагрузки. Применяется исключительно в сухих условиях.
- OSB-3. Наиболее распространенный в отделке и строительстве класс материала. Может выдерживать несущие нагрузки и обладает оптимальным соотношением цены и функциональности. Технические характеристики плиты OSB-3 обеспечивают применение материала в том числе и во влажных условиях.
- OSB-4. Это наиболее прочные и дорогие материалы. Повышенная надежность позволяет использовать материал в строительных конструкциях с большими нагрузками во влажных условиях.
Характеристики
ОСБ – это плиты, являющиеся производным продуктом переработанных древесных отходов. В их составе присутствуют небольшие волокна, остаточный мусор от обработки хвойных деревьев и щепки. Роль связующего компонента исполняет смола.
Современные производители готовы предложить покупателю несколько видов ОСБ-плит, каждый из которых обладает рядом достоинств, но имеет и некоторые недостатки.
Выбирая ту или иную разновидность, важно учитывать основную цель предстоящих работ
Древесно-стружечные плиты.Этот материал не отличается хорошими показателями плотности. Он мгновенно впитывает влагу, из-за чего разрушается структура плиты. Такие экземпляры рекомендовано применять в мебельном производстве.
OSB-2.Данная разновидность плит отличается высоким показателем прочности. Но во влажной среде портится и теряет основные качества. Именно поэтому представляемую разновидность ОСБ следует применять для внутренней отделки помещений со стандартным показателем влажности.
OSB-3.Наиболее востребованная разновидность плит, характеризующаяся высоким показателем прочности. Их можно использовать в помещениях с регулируемой влажностью
Многие строители утверждают, что плитами OSB-3 можно обшивать фасад зданий, и в принципе это так, только важно продумать вопрос их защиты. Например, использовать специальную пропитку или покрыть поверхность краской.
OSB-4.Представляемая разновидность является самой прочной по всем параметрам
Такие плиты легко переносят влажную среду, не требуя при этом дополнительной защиты. Но, к сожалению, спрос на OSB-4 очень низок, причина тому – высокая стоимость.
Далее предлагается ознакомиться с техническими характеристиками, характерными для всех разновидностей ОСБ-плит.
- Повышенный уровень прочности. Правильно подобранная толщина сможет выдержать большой вес.
- Гибкость и легкость. Благодаря этим характеристикам с помощью ОСБ можно оформить элементы округлой формы.
- Однородность. В процессе работы целостность фактуры ОСБ-плит не нарушается.
- Влагостойкость. Если сравнивать с натуральным деревом, ОСБ-плиты не теряют внешней красоты.
- Податливость. При резке пилой ОСБ не крошится, а места срезов получаются ровными. Аналогичный эффект от проделывания отверстий дрелью.
Стоит отметить, что ОСБ-материал также отличается отличной звуко- и теплоизоляцией. Наличие специальной пропитки оберегает плиты от возникновения плесени или грибка.
Замковая система «Click»
Классификация OSB-плит
Выделяют 4 класса OSB:
- OSB 1. Обладает самой низкой влагостойкостью. Допустимо применение в ненагруженных конструкциях в условиях низкой влажности
- OSB 2. Также обладает низкой влагостойкостью, но может подвергаться несущим нагрузкам. Допустимо применение в условиях низкой влажности
- OSB 3. Наиболее распространённый класс материала. Допустимо применять во влажных условиях, подвергать несущим нагрузкам. Популярность объясняется оптимальным соотношением цена-качество
- OSB 4. Самый качественный материал. Допустимо применение во влажных условиях при больших нагрузках. Наиболее дорогой материал, поэтому не нашёл широкого распространения
Большая часть применяемых OSB-плит относится к классу OSB 3, что это такое – самый распространённый класс ориентированно-стружечных плит.
Плита OSB 3Источник mirtepla.msk.ru
Принцип изготовления плиты
Принцип изготовления ОСП панелей заключается в прессовании щепок во множество слоев путем воздействия на них высоких температур и давления. Для того, чтобы щепки плотно прилегали и не выпадали, а слои были равномерными, их покрывают смолами на формальдегидной или феноловой основе.
(Картинка кликабельна, нажмите для увеличения)
Полученную смесь дополнительно закрепляют воском для наибольшего сцепления. Использование при создании плит станков последнего поколения придает изделиям идеальную поверхность без появления сколов и лишних щепок, выглядывающих из внутренней и внешней стороны.
Весь процесс производства состоит из таких этапов, как:
- формирование щепок из древесины;
- процесс высушивания и обработки щепок;
- установка элементов по ориентировочному направлению;
- покрытие стружки смолой;
- работа по прессованию и разрезанию плит.
Производители разделили плиты на четыре класса:
ОСП-1 – это первая категория материала, применяемая в помещениях с повышенной сухостью и только для внутренних работ.
ОСП-2 также применяют исключительно для внутренней отделки жилища и в каркасном производстве мебели.
ОСП-3 – это самый востребованный вид плит, который применяется при проведении внешних и внутренних отделочных работ. Отличается повышенной стойкостью к износу, и не портит структуры под воздействием влажных масс.
ОСП-4 – это самый высокий класс по прочности материала, но его редко применяют в обычном строительстве дома, потому что цена на подобное изделие значительно выше, чем на вышеперечисленные.
ОСП-3 панели отвечают всем последним разработкам в области строительных технологий и отличаются устойчивостью к влаге. Именно это качество делает их популярными при выборе облицовочных материалов, в частности, в каркасном строительстве.
Плита выдерживает влагу, но с одним условием, о котором нельзя забывать: плита способствует защите здания только при непродолжительном контакте с водой.
Если установить панели в ванной, то нужно проводить обработку специальными составами, препятствующими промоканию изделия и, как следствие, потере его полезных свойств.
Узнаем из видео о расшифровке, плюсах и минусах ОСБ, сфере применения, о том, как его правильно выбрать и как с ним работать:
OSB (ОСП) плиты. Особенности, производство, сильные и слабые стороны.
Сегодня речь пойдет об OSB плитах. И только наша компания может предложить выгодные цены при оформлении заказа. Клиенты всегда могут рассчитывать на хорошие предложения, от которых невозможно отказаться.
OSB
Что представляют собой OSB плиты? В полной расшифровке аббревиатура выглядит так – Oriented Strand Board или ориентированно-стружечная плита. Для производства этого материала используется древесная щепа (90%) с включением специального клеящего состава.
За счет использования особенной технологии производства плит, готовая продукция наделяется специфическими качествами, которые ничуть не уступают цельной древесине, а то и превосходят ее. Суть изготовления плит сводится к следующему. Исходным сырьем выступает плоская продолговатая древесная щепа, из которой формируются три слоя. Каждая плита состоит из трех таких слоев. При формировании щепа контактирует с клеящим составом на основе водостойкой смолы. Это наделяет ее влагостойкими свойствами.
На производство плит подходит щепа не любого размера, а только определенных габаритов:
- длина – от 50 до 150 мм;
- толщина – не более 0,6 мм.
Формирование плит происходит в специальном прессе, где они подвергаются воздействию высокой температуры и давления. Что касается исходного материала, то обычно в ход идет древесина хвойной породы (сосна, ель) и лиственные представители (осина, тополь).
Сами слои укладываются в определенном порядке:
- Нижний и верхний слой формируются одинаково – щепы в этом случае ориентированы в продольном направлении относительно длины плиты.
- Средний – теперь волокна направлены уже в поперечном направлении по отношению к другим двум слоям.
Клеящий состав может также варьироваться в зависимости от требуемых свойств и применения. Для этого используется та или иная основа:
- Синтетический воск – в целях повышения водостойкости готовой продукции и качества соединения.
- Борная кислота – для увеличения биостойкости плит, что позволяет им противостоять воздействию продуктов жизнедеятельности живых организмов.
- Фенолформальдегидная смола – еще один вариант повысить водостойкость материала. (В технологии современного производства строительных материалов накладывается запрет на использование этой смолы либо существенно ограничивается ее включение в конечные продукты).
Что касается слоев, то к наружным поверхностям актуален клей с включением карбамидоформальдегидной либо меламиноформальдегидной смолы. Только такие плиты не рекомендуется приобретать для работ внутри жилых зданий.
Внутренний слой может формироваться в сочетании клеящего состава, где присутствует мочевиноформальдегидная или фенолформальдегидная смола. Последняя разновидность основы встречается крайне редко.
Классификация OSB
Исходя из нужных качеств и сферы применения, производятся 4 основных вида плит:
Первый класс подходит для сухих условий эксплуатации, где отсутствует прямой контакт с влагой. В частности это внутренние перегородки домов, изготовление упаковочной тары для различного оборудования, обшивки, предметов мебели.
Вторая категория служит основой для изготовления несущих конструкций, эксплуатируемых в отсутствии влаги.
Третья группа – из этих плит также делаются несущие конструкции, но уже допустима повышенная либо переменная влажность. Причем не только внутри здания, но и за его внешними пределами.
OSB-4 – это самые прочные и водостойкие плиты, которым не страшен высокий уровень влажности, а также большие нагрузки.
Сильные стороны
Стоит перечислить несколько качеств плит, которые одновременно являются их преимуществами:
- Прочность – на высоком уровне! Материал способен противостоять колоссальной нагрузке номиналом от 100 до 300 кг в зависимости от толщины плит. По этому показателю OSB значительно превосходит качество фанеры или ДСП. (Для сравнения в табл. 2 характеристики OSB плит, а табл. 5 содержит параметры материала от другого производителя).
- Листы упругие и обладают небольшим весом. Массу можно посмотреть в табл. 4. Набухание плит под воздействием влаги составляет от 17 до 25% если их погрузить в воду на сутки. Но даже в таком состоянии материал остается довольно прочным (снижается лишь малая ее часть).
- OSB плиты – это однородный и структурный материал.
- Легкость в работе – листы поддаются практически любой механической обработке (резка, сверление, пробиваемость гвоздями, использование саморезов и прочего крепежа). Также можно покрывать плиты различными специальными средствами, включая лакокрасочные составы.
- тепло- и звукоизоляция на высоком уровне.
- У материала хорошая биостойкость, а это исключает появление различных грибков (включая и плесень) и прочих живых нежелательных организмов.
- Диапазон рабочей температуры и разрешенный к эксплуатации плит составляет от -50 до +40 градусов по Цельсию.
- Долговечность! В нормальных условиях эксплуатации материал не ограничен по сроку службы.
- Дополнительная обработка OSB плит позволяет заметно повысить водо- и огнестойкие качества.
- Листы обладают способностью удерживать крепежные элементы (шурупы, гвозди) как у древесины.
- OSB материал соответствует требованиям международного гигиенического класса Е1.
Слабые стороны
К сожалению, наряду с явными преимуществами у плит есть и некоторые недостатки, которые также следует учитывать. По большей части это касается дешевых листов от недобросовестных китайских и некоторых отечественных производителей, которые используют фенолформальдегидные смолы в качестве клеящей основы. А такое соединение наносит вред человеческому организму.
В связи с таким риском, покупателям необходимо проверять сертификат, где должен фигурировать класс Е1 либо Е0. Помимо этого, стоит учитывать, что в качественном материале содержание вредных веществ намного меньше, чем в других аналогах:
Среди других минусов (опять-таки продукции от квалифицированных специалистов) модно отметить низкий уровень паропроницаемости и плохую работу на излом.
Сфера применения
OSB материал благодаря своим свойствам выступает в качестве неплохой альтернативе традиционной древесине, фанере, ДСП, МДФ. А это существенно расширяет границы использования плит:
- Для обшивки каркаса построек и формирование внутренних перегородок.
- Обустройство полов и их выравнивание.
- В качестве основы под какой-нибудь кровельный материал (битумная черепица и прочие варианты).
- Изготовление предметов мебели.
- Сооружение опалубки при бетонировании.
- Строительство ограждений временного пользования.
- Изготовление ящиков для транспортировки грузов, товаров.
- Для создания облегченных элементов конструкций автомобильного транспорта, кораблей, поездов.
- Производство билбордов.
Плиты поставляются прямиком с завода производителя, что позволяет рассчитывать на минимальную наценку. Мы предоставляем максимально доступную стоимость, а потому наше сотрудничество вне конкуренции. Это подтверждается индивидуальным подходом к каждому обратившемуся клиенту. Это обеспечивает максимальный уровень комфорта при деловом общении.
Отделка ОСБ (OSB) плит — VB-ремонт
Что представляет собой ОSB (ОСП) плита? Расшифровка аббревиатуры OSB – Oriented Strand Board или ОСП – ориентированно-стружечная плита. На первом месте – экологическая безопасность стройматериала, почти полностью, на девяносто процентов, составляющегося из дерева. Несколько слоев ориентированной стружки входит в плиту, 3-4 обычно. Слой стружек налаживается поперек один на другой. Это все скрепляется водостойкими смолами. ОСБ плиты известны своими физическими, механическими показателями: все важные характеристики в два…три раза лучше аналога – ДСП. Устойчивы даже к чрезмерной влажности, практичны в эксплуатации.
Итак, как отделывать ОСБ плиты? Где будут отделываться ОСБ плиты, такой перечень действий и инструментов необходимо к ним и применять. Начнем с обработки полов, выполненных данными плитами.
Как улучшить пол, выложенный ОСБ плитами?
Материал – дерево. Значит, брать надо составы, что используются для обрабатывания цельной древесины. Основываясь на целесообразности, запланированных издержках, его можно полакировать или покрыть краской.
Лакировка. Перед лакировкой пола необходимо убрать шероховатость поверхности, шершавость. Иначе щепки будут задеваться за носки и пол будет неровным. Затем производят грунтовку, очищение и обезжиривание поверхности.
Если на плиты ложатся сверху ламинированные листы, то шлифовка не нужна.
Добившись гладенькой поверхности плиты, беремся за следующий этап – нанесение лака. Лакирование происходит двумя, тремя слоями. Можно взять бесцветный лак, для подчеркивания натуральности цвета обрабатываемой поверхности, можно затемнить или осветлить поверхность соответствующими лаками.
Покраска. Масляной состав самый распространенный вариант покраски. Он наиболее естественен, не нарушает пористость обрабатываемого материла, позволяя ему «дышать». Краска – наиболее бюджетный вариант, без чрезмерных усилий и расходов.
Сначала необходимо поверхность обработать шпатлевкой, для удаления стыков, неровностей. Затем необходимо аккуратно прошлифовать поверхность (если она не лакированная).
Материал, подготовленный таким образом, обработать необходимо грунтовкой. Впоследствии краска распределится равномерно по поверхности. Биотекс, другие составы красок мажут валиком в 2 слоя. Перед обработкой пола необходимо проверить цвет на маленькой площади, во избежание недоразумений.
Декоративное покрытие. На поверхность плиты укладываются любые из напольных изделий – паркет, ламинат, линолеум, паркетная, керамическая плитка. Важно, чтоб основание материала было ровное, неподвижное. Потому необходимо заделать герметиком компенсационные зазоры и произвести шлифовку.
Если покрытие составлено одним толстым листом, то длина от лага до лага уменьшится до 30-40 см.
Под покрытие рекомендуется при укладке лучше всего использовать два тонколистных пласта по 8-10 мм, один поперек другого, перпендикулярно. Соединить их между собою следует клеем для паркетов и зафиксировать саморезом.
Затем подготавливают необходимый клеющий состав для определенного материала, которым будет обрабатываться поверхность, в данном случае – пол, из ОСБ плит.
Отделка ОСБ-стен – внутренняя
В процессе изготовления ОСБ плит, в них происходит добавление связывающих веществ, обычно олигомерных смол. Поэтому, чтобы эти вещества во время транспортировки не просочились наружу плиты, необходимо поддать ее грунтовке. Подойдут такие же составы, что и для пола.
Для поверхностей гладких и покрытых ламинатом рекомендован вместе с грунтовкой кварцевый песок. Так отделка закрепляется прочнее. Затем приступаем к лакированию и покраске поверхности.
Покраска ОСБ-стен. Каким образом будет происходить покраска, зависит от того, хотите вы, чтобы структура ОСБ плиты была сохранена, или же сделать ее ровной, гладенькой. В первом случае покраска производится на грунт непосредственно. Во втором случае же это происходит следующим образом:
- Клей наносим, 3-х мм слой. Сгодится любой эластичный древесной состав.
- Армированную сетку вдавливаем в клей, которая применяется в фасадных работах.
- Наносим еще один слой, уже 1 мм, того же клея, после высыхания. Он способствует выравниванию поверхности сетки и более надежно закрепляет ее.
- Наносим на поверхность гипсовую универсальную шпатлевку.
После этих процессов можно красить, делать декоративную штукатурку.
Поклейка обоев на ОСП. Грунтовка обязательна при поклейке обоев, поскольку, если нацепить их непосредственно на плиту, то древесина будет впитывать влагу, и просто-напросто обои отпадут, отклеятся. Грунтовка придаст поверхности влагозащитных свойств. В клей советуют добавлять немножко ПВА.
Отделка ОСБ-стен – внешняя
Отделка стен снаружи происходит с помощью различных традиционных материалов: сайдинга, блок-хаусов, панелей ПВХ, клинкерной плитки и др.
В случае, если ОСП ничем не закрывают, а лишь лакируют, то поверхность склонна со временем к потемнению, через влияние ультрафиолета (на прочности это не отражается). Проверена и испытана эффективность ламинированных плит более светлого оттенка, их лучше всего использовать, поскольку они более устойчивы к действиям природных явлений сохраняют свою эстетичность на протяжении многих лет, даже если с внешней стороны их поверхность ничем не закрывать.
Более экономный вариант – краска. Можно пользоваться любой, предназначенной для работы с древесиной на внешней стороне. Но необходимо будет подготовить поверхность дома определенным образом:
- В процессе сборки дома предусмотрены компенсационные зазоры, которые находятся в промежутках между листами, предназначенными для стен. Эти зазоры нужно старательно заделать акриловым герметиком, не оставляя места полостям воздуха во швах, ибо внутри них находятся торцы плит, которые следует обработать, они то и подвержены воздействию факторов разрушения. Естественно, после окончания процедуры, «хвосты», которые торчат, срезают.
- Обработка кромок и рёбер плит. Ребра и кромки плит – участки материала, которые имеют наиболее пористую структуру, более всего уязвимые к влаге, воде и другим разрушающим факторам. Поэтому, в первую очередь, обращают внимание на кромки плит при выборе материала, каким будут покрывать ОСБ, их по несколько раз обрабатывают при грунтовке, проверяя тщательность и эффективность работы, чтобы не просачивалась вода и поверхность была наиболее влагостойкой.
- Естественно, после окончания процедуры, «хвосты», которые торчат, срезают.
- Чтобы распределение составов грунтовки и краски происходило более равномерно, необходимо скруглять острые края углов плит.
- Часть составов грунтовки и герметиков имеют способность изменять цвет при попадании солнечного луча на них. Поэтому нужно уделять им больше внимания. Нужно убедиться, что покупаемые средства – для работ с внешней стороны поверхности. Нежелательно выбирать составы на водяной основе, они зачастую приводят к разбуханию древесины, к деформации структуры поверхности плиты. Масляные средства – самое то.
Далее все по стандарту – равномерно наносят один слой краски, дают ему высохнуть, наносят второй, и так до тех пор, пока не добьетесь нужной Вам насыщенности цвета. Инструменты для обработки поверхности не сложные, навыки просты – это может осилить практически любой человек. Обрабатывать при необходимости ОСБ плиты (листы) намного проще и легче, чем цельную древесину.
Расшифровка: как на самом деле работают вакцины?
Вакцины — это лекарства, которые тренируют организм защищаться от будущих болезней.
В отличие от других лекарств, которые мы даем некоторым людям, когда они больны, мы делаем вакцины огромному количеству людей, пока они здоровы. Это одна из причин, по которой вакцины проходят столь обширные испытания.
Вакцины действуют, моделируя инфекцию в организме. Это не настоящая инфекция, но она учит иммунную систему распознавать и нейтрализовать подобные патогены позже.Если иммунная система может остановить размножение вирусов, они больше не представляют опасности для здоровья вакцинированного человека.
Мы использовали эту стратегию для разработки десятков вакцин за сотни лет.
Люди делали иммунизацию на протяжении веков, начиная с Индии и Китая. К началу 1600-х годов люди намеренно заражали детей крошечными дозами оспы в процессе, называемом «вариоляцией». Вариация была фатальной примерно в 2-3% случаев. Но это сделало детей невосприимчивыми к болезни, которая обычно была смертельной примерно в 30% случаев.
В 1717 году леди Мэри Монтегю, жена британского посла в Турции, представила эту технику британскому медицинскому истеблишменту. Она узнала о вариоляции от османских практикующих, а затем использовала ее для иммунизации собственных детей.
Десятилетия спустя врач Эдвард Дженнер узнал, что британские работники молочной фермы открыли еще более безопасный способ защиты от оспы: вводили людям коровью оспу, родственное, но менее смертоносное заболевание, которое, как выяснилось, дает иммунитет.Дженнер проверила теорию, введя восьмилетнему мальчику соскоб с волдырей коровьей оспы доярки. К счастью, это сработало.
Когда иммунная система обнаруживает вирус, она вырабатывает антитела для его нейтрализации. Цель состоит в том, чтобы заблокировать связывание вируса со здоровыми клетками, чтобы он не мог реплицироваться.
Поскольку вирусы оспы связаны между собой и используют сходные связывающие белки, антитела коровьей оспы также защищают пациентов от оспы. И было гораздо безопаснее вводить больным коровьей оспой инъекции, чем оспу.
Мы больше не иммунизируем людей, вызывая у них болезни. Вместо этого мы используем вакцины, которые действуют аналогично, но намного безопаснее.
В 1930-х годах исследователи обнаружили, что можно инактивировать вирусы сезонного гриппа с помощью раствора формальдегида. Сам по себе формальдегид токсичен. Но люди, которым вводили инактивированные вирусные частицы, в конечном итоге выработали защиту от гриппа.
Чтобы сделать вакцину против гриппа для широких слоев населения, исследователям просто нужен был контролируемый способ генерации большого количества вирусных частиц, их инактивации и последующего сбора.
На основе некоторых ранних экспериментов исследователи обратились к оплодотворенным куриным яйцам, в которых вирусы размножаются исключительно быстро.
Первые вакцины против гриппа были выпущены в 1940-х годах. Даже с учетом последних достижений в технологии клеточных культур около 80% вакцин против гриппа по-прежнему производятся с использованием куриных яиц — сотни миллионов из них поступают с ферм, которые правительства держат в секрете, чтобы защитить их от подделки.
Мы также можем делать вакцины с использованием живых вирусов, достаточно ослабленных, чтобы они фактически не вызывали болезнь.В качестве альтернативы мы можем использовать неинфекционные части вирусов или частицы, созданные так, чтобы они напоминали патогены.
Последняя стратегия ученых по борьбе с вирусами заключается в использовании РНК-мессенджера, которая впервые применяется для борьбы с SARS CoV-2, вирусом, вызывающим Covid-19.
Чтобы создать вакцину с мРНК, специалисты начинают с секвенирования вирусного генома и поиска инструкций о том, как он связывается со здоровыми клетками. Оказывается, что SARS CoV-2 связывается с помощью белков-шипов, которые исследуют поверхность вируса.
Затем ученые копируют и упаковывают эти генетические инструкции и вводят их здоровым добровольцам, чтобы клетки их тела начали производить свои собственные белки-шипы (но не прикрепленные к какому-либо вирусу). Таким образом, пациенты создают свой собственный план критически важной части вируса, чтобы их иммунная система научилась определять и нейтрализовать.
Вакцины с мРНКраньше не использовались широко, в основном потому, что искусственную РНК-мессенджер сложно поддерживать в неприкосновенности достаточно долго, чтобы она достигла клеток-хозяев.Но ученые преодолели это препятствие с помощью новой технологии (в частности, синтезируя более совершенные ферменты, фланкирующие последовательности планов), и теперь они могут создавать вакцины невероятно быстро. Что касается SARS-CoV-2, они также внесли изменения в РНК, так что она произвела очень стабильную версию белка-шипа, который иммунная система могла легко распознать — естественный шип вируса как бы колеблется в беспорядочной манере ..
Исследователи смогли синтезировать РНК для вакцины SARS-CoV-2 в течение недели после секвенирования генома вируса, еще в январе 2020 года.Это позволило им начать первую фазу испытаний лекарств к марту прошлого года.
Вакцины — не чудодейственные лекарства: они не делают каждого человека невосприимчивым к болезням. Но важно то, что они работают на уровне населения.
Ключом к успешной программе вакцинации является иммунизация достаточного количества людей для развития так называемого «коллективного иммунитета», при котором большинство инфицированных не может передать его кому-либо еще. Таким образом, со временем все меньше и меньше людей заражаются, в идеале до тех пор, пока болезнь не будет полностью уничтожена.
Болезни по-прежнему представляют опасность, пока где-то есть случаи.
В этом году мы стали свидетелями крупнейшей в истории международной разработки вакцин. SARS-CoV-2 показал, как быстро болезни могут распространяться в нашем глобализированном мире. Теперь мы собираемся выяснить, достаточны ли методы вакцинации, которые мы разрабатывали на протяжении веков, для решения этой задачи: сможем ли мы развить глобальный коллективный иммунитет или многие страны будут продолжать бороться.
Речь идет не только о выходе из этой пандемии, но и о создании быстрой и эффективной стратегии борьбы с будущими инфекциями.Они могут быть неизбежными, учитывая, сколько вирусов, похоже, готовы перейти от животных к человеку.
В настоящее время и в ближайшие десятилетия вакцины, вероятно, будут ключом к обеспечению нашего коллективного благополучия и, возможно, нашего выживания.
Разъясненных | Журнал STANFORD
Сидя в фургоне на жилой улице в Редвуд-Сити, Рич Брэгг выбирает один трюфель из коробки с двумя дюжинами. Он осматривает его, нюхает и откусывает небольшой кусочек.Он деликатно жует. Затем он беспечно возвращает недоеденную конфету на ее квадрат в коробке.
«Я пробую кокосовый орех», — объявляет он своим друзьям, которых, похоже, не беспокоит нарушение этикета. А затем более решительно: «Когда мы закончим, это должен быть материал по криптограмме».
Rich, MS ’00, MS ’02, сегодня играет не по правилам мисс Маннерс.Он вступил в The Game, пьянящее соревнование, в котором используются такие слова, как криптограмма, ASCII и PerlScript.
Проще говоря, Игра — это гонка, решающая головоломки. Команды из четырех-десяти игроков разъезжают по заливу в поисках улик, которые включают сбор данных, расшифровку и даже немного перформанса.Каждое решение ведет команду к следующему пункту назначения — и подсказывает. Большинство команд пересекают финишную черту примерно за 24 часа, в то время как некоторые хромают 36 дней подряд. Победители получают место в истории игр и возможность отправиться домой в постель.
Но вернемся к коробке с 24 трюфелями. После дальнейшего отбора проб и размышлений — имейте в виду, что это займет два часа — команда Рича решает загадку.Это не криптограмма, как предполагал Рич. Положение трюфелей в коробке, а также их вкус и упаковка (порошковые или не порошковые) соответствуют точкам алфавита Брайля. После расшифровки трюфели произносят: «Иди в Менло Парк Кеплерс».
Рич сжигает резину на улицах Менло-Парка. Кажется, он разрывается между облегчением, эйфорией и ненавистью к себе. Трюфелей в сетке 3х8, , кажется, говорит он себе. Что еще это могло быть, кроме шрифта Брайля?
Идея этого ментального марафона зародилась в группе старшеклассников в Клируотере, штат Флорида, в середине 1980-х годов. Джо Бельфиоре и его приятели организовали ночную охоту за мусорщиками под названием «Полночное безумие», вдохновленные практически неповторимым одноименным фильмом 1980 года.Когда Бельфиоре поступил в Стэнфорд, он принес с собой свою Игру.
Стэнфорд с его обширным живописным кампусом и множеством умных штанов, всегда ищущих проблемы, оказался идеальным местом для игры. Шесть Игр прошли на Ферме под эгидой Бельфиоре. Сейчас генеральный менеджер подразделения Microsoft Windows eHome в Сиэтле, Бельфиоре, 90-е годы, по-прежнему участвует в ежегодных Играх со своими коллегами из высоких технологий.И его детище разыгрывается по всей стране. Когда-то игра была довольно секретной, но сейчас она процветает в сообществах от Нью-Йорка до Мичигана и Массачусетского технологического института. Мини-игры, которые длятся всего семь часов или около того, используются для создания корпоративного единства или объединения выпускников разных школ Лиги плюща. Но сообщество Стэнфорда / Залива по-прежнему принимает самую большую в стране группу добросовестных игроков: около 40 команд соревнуются раз в полгода.
Способность к этим анаграммам или поиску слов на странице комиксов не предвещает даже намека на успех в Игре. С годами подсказки стали более сложными и изящными, так же как игроки стали немного старше и богаче (большинству около 28 лет, 80 процентов — мужчины). Одна из недавних подсказок требовала, чтобы игроки носили акваланг, чтобы решать эту задачу под водой.Другой имитировал трехмерный лабиринт посреди пустыни Невада. Это непростые задачи для людей, которые занимаются спортом, как правило, только в фантастических лигах.
Бельфиоре, который недавно начал игру в Сиэтле, бомбардировав игроков с пикирования с вертолетов, говорит, что команда, не оснащенная ноутбуками, устройствами GPS, сотовыми телефонами, рациями и портативным копировальным аппаратом, «не молится.Однако помощь доступна. В любой момент команды могут позвонить в Game Control, дизайнерам мероприятия, которые подтвердят предположения или предложат загадочные подсказки, чтобы подтолкнуть команды вперед. Они также отслеживают прогресс команд, чтобы никто не сделал неверных предположений и не оказался, скажем, в Канзас-Сити.
The Game — это один большой geekfest, время отмечать супер-умных людей, делающих супер-умные вещи, в то время как все делают вид, что им все равно, выиграют они или проиграют.Это требует церебральной гимнастики и физической выносливости. Это требует межличностного терпения. Это требует, чтобы человек воздерживался от сна, квадратного обеда, TiVo. Это — поработайте со мной сейчас — своего рода героическое путешествие, цикл испытаний и самопознания, хорошо пройденный такими людьми, как Одиссей, Гильгамеш и всеми другими паладинами из учебной программы первокурсников.
Вестник прозвучал в ноябре 2001 года.Весной 2003 года команда из шести человек, известная как Orange Crush, будет разрабатывать игру. Их тема — The Goonies, — банальный фильм 1985 года Стивена Спилберга, сюжет которого вращается вокруг охоты за сокровищами. Сначала командам нужно было подать заявку и пройти викторину по мелочам из фильма. Те, кто попал в срез — 20 команд, 112 игроков — были приглашены на встречу в 9:30.м. в апрельскую субботу в парке Твин-Пайнс в Белмонте. Каждая команда заплатила 170 долларов, чтобы компенсировать 3400 долларов, потраченных Orange Crush на планирование и изготовление подсказок.
Как раз вовремя, Рич подъезжает со своей командой на буксире: Сара Барнум, ’01, Крис Ченг, MS ’00, PhD ’03, Роберт Ченг, MS ’99, Рико Фишер, MS ’02, Скотт Крюгер, MS ‘ 00, Майк Хольцбаур, MS ’01, и невеста Майка, Кейт Сол, MS ’02 — группа кандидатов наук, постдоков и высокотехнологичных сотрудников.В совокупности они известны как Кровь и Кости, отсылка к отделу биомеханической инженерии, представленному этими степенями магистра. Среди них они сыграли в 30 играх. Обычно они входят в тройку лидеров. Но они неконкурентоспособные люди, как они сразу отмечают.
По слухам, побежденные команды — это Медный горшок, седая группа ветеранов Игры, и Адвил, которые прибывают широко улыбаясь, носят хрустящие гавайские рубашки и раздают Бэби Рутс в знак уважения к персонажу Goonies Chunk.Оказывается, несколько членов Advil посещали Калифорнийский университет в Беркли в начале 1990-х, когда Джефф Коэн, игравший Чанка, был президентом студенческого совета. Дружелюбие Адвила в сахарной глазури внушает полную уверенность.
Кровь и кости, похоже, тоже все под контролем. Забираясь внутрь, я замечаю, что их фургон был переконфигурирован, чтобы создать своего рода Круглый стол.Друзья стали помощниками по телефону для экстренного поиска в Google. Бутерброды упакованы; пит-стопы будут сделаны только тогда, когда группа остановится, чтобы работать над подсказкой. И игроки знают свои задания: Сара, новичок в команде, подойдет к каждой подсказке, используя простые числа или язык жестов; Роберт, тихий, воспользуется семафором или шифром Playfair.Как известно геймерам, отсутствие четкой стратегии ведет к самоуничтожению. Геймеры также знают, что четкая стратегия рушится, когда вы смотрите на головоломку в 4 часа утра.
Атмосфера вокруг Twin Pines — это часть фестиваля Burning Man, часть конвенции Dungeons & Dragons. Можно почувствовать стремление выйти за пределы банальности, быть настолько гиковским, насколько вы хотите.Даже на фоне агрессивной дурацкости ярко-синяя хирургическая униформа Blood and Bones выделяется.
Orange Crush собирает войска и издает возгласы сплочения. Правило №1: получайте удовольствие. Если кому-то не весело, позвоните в Game Control. № 2: Ничего не ешьте с «мистером. Фу! »Наклейка на нем. Все приветствуют. Вызывается номер телефона Game Control.Одновременно программируется звук 112 топовых сотовых телефонов.
Orange Crush раздает пакеты с деталями для решения головоломок для более поздних улик. Кровь и Кости получают первую сумку в качестве победителей предигрового теста « Goonies ». Они делают фургон безумным бревном. Рич издает воинственный крик. Их настроение не могло быть более восторженным: на 35-й минуте The Game Blood and Bones лидируют.
Преодоление порога
Экскалибур был у короля Артура. У Люка Скайуокера был световой меч. У Blood and Bones есть 14-местный фургон Ford E-350 XLT Super Duty. В нем есть, помимо прочего: ноутбуки с GPS и программным обеспечением для взлома кода, рации, цифровая камера, инвертор питания, удлинители, карты AAA, руководство Thomas, транспортир, компас для рисования, рулетка, копировальный аппарат, штангенциркуль, ножницы и т. Д. пинцет, увеличительное стекло, бинокль, наждачная бумага, цифровой мультиметр, таблетки от укачивания, Gatorade и большая черная папка с 191 страницей кодов и списков, от кодонов ДНК до символов китайского зодиака и фобий.По просьбе Orange Crush они также упаковали QuickTime Player, Flash 6, молоток, отвертку и «огонь (больше похож на зажигалку, а не на паяльную лампу)». Предполагаемое использование огня вызывает дрожь в команде.
Рич разгоняет фургон. Рядом простаивают соревнующиеся машины, все команды хотят сэкономить 10 секунд, чтобы запустить их моторы.Всякий раз, когда кто-то отстраняется, головы взрываются, чтобы вздрогнуть, глядя на уходящую команду.
Улика № 1 вызывает разногласия, которые происходят во время Игры. Это лист бумаги с Goonies, ссылками, списком парных имен и адресов и вторым списком «спонсоров». Рич делает ксерокопии для всех.Внимательно изучите каждое слово, букву и цифру. Может ли «Бритни» относиться к бретонским спаниелям? Может ли «Эльсинор» быть ссылкой на Hamlet или на пивоварню в фильме « Strange Brew»? Рико с упорством на Среднем Западе собирает возможные телефонные номера из цифр на странице и делает холодные звонки.Крис считает, что эти имена как-то связаны с 50-летием открытия двойной спирали ДНК, которое приходится на этот год. Сара указывает, что это также 50-летие Marshmallow Peeps, но это их ни к чему не приведет. Что-то в этой череде намеков заставляет Рича подумать о «Семейном цирке».
«Не думайте о« Семейном цирке », — говорит Кейт.
Проходит девяносто минут.
Рич смотрит в окно. «Мы какое-то время были ведущими, — вздыхает он. Он проводит рукой по своим обесцвеченным светлым волосам. Привет, добавляет он, разве Эйвери не была бывшей женой Джерри Магуайра из сериала ?
Крис, который спал накануне всего шесть часов, предлагает позвонить в Game Control, чтобы получить подсказки.Остальные угрожают выгнать его из фургона. Крис зевает и говорит, что ему нужен кайф.
Майк сидел на переднем сиденье загадочно тихо. Кейт говорит, что он темная лошадка команды, и вскоре он доказывает, что она не просто обожающая невеста. В 11:28 он произносит три слова, которые являются Граалем Игры: «Я понял!»
Это слуховая подсказка. При произнесении имени первого спонсора — «Великие псы» — звучит цифра 8.Подсчитав восемь букв, получится буква «g» в слове «Dogs». (Если вы можете понять, почему следующий, «Pogo California», выдает «о», возможно, вы обладаете задатками Геймера.) Таким образом, слова постепенно описывают место в Редвуд-Сити.
Rich отшелушивает.
После этого вялого старта Blood and Bones пошли вперед, преодолевая одно испытание за другим с титанической эффективностью.Они разбивают миниатюрную статую Давида , чтобы удалить закодированные полоски пакетов с картофельными чипсами. Они расшифровывают скульптуру из семафорных флагов с вершины Гуверовской башни. Они почти поджигают фальшивые 50-долларовые банкноты, а затем — как раз вовремя — обнаруживают скрытое сообщение, встроенное в серийные номера.
Путешествие ведет из Бельмона в Фремонт и Милпитас, где стрелка спидометра показывает отметку 80.На каждой остановке они быстро просматривают Адвил и Медный горшок, которые неизменно их побеждают. Но к 20:03, когда Кровь и Кости прибывают в Shark Tank в Сан-Хосе, чтобы разложить 51 мини-картон мороженого (с наклейками мистера Юка) и сложную криптограмму, лучших команд нигде не видно.
«Может, они всех вытирают», — говорит Скотт, чьи очки в металлической оправе и легкая вспыльчивость заставляют его чувствовать себя как дома в своих хирургических скрабах.
Я обращаю внимание на то, что не более 12 часов назад Blood and Bones заявили, что веселье важнее победы.
«Победа — это весело», — настаивает Рич.
Картонные коробки с мороженым содержат «подсказку запаха», отдавая дань уважения восклицанию Чанка Goonies : «Я чувствую запах мороженого!» С быстрым расследованием и еще одним небольшим количеством догадок от Майка, Блад и Кости разрываются.Адвил и Медный горшок, прибывшие с тех пор, все еще нюхают картонные коробки и чешут в затылках. Через двенадцать часов игры Blood and Bones «уничтожают» улики с такой свирепостью, что Game Control просит их притормозить, иначе некоторые не будут на месте. Они близки к тому, что называется «нарушением игры».”
Рич хихикает, не желая сбавлять темп.«Скажи им, что мы надираем чертову задницу!»
В субботу вечером в 9:30 фургон с ревом проезжает через центр Сан-Хосе по пути в университет Санта-Клары. Двадцатилетние и тридцатилетние люди выстраиваются в очередь в барах для брачного ритуала с кожаной курткой и мини-юбкой. Кровь и Кости, кажется, не замечают очереди симпатичных девушек, голых ног, пульсаций похоти и вечеринок на одну ночь, формирующихся вокруг них.Они до сих пор радуются своей победе над 51 вкусом мороженого.
«Это было прекрасное решение, ребята», — говорит Скотт, когда фургон увеличивает отрыв.
Высшее испытание
Подобно тому, как Беовульф столкнулся с Гренделем, а Ахиллес пошел на мано с Гектором, каждый герой сталкивается с величайшим испытанием. Это своего рода кульминация, шанс раз и навсегда доказать, из чего он на самом деле сделан.Для Blood and Bones это начинается почти в полночь, на пороге того, что в Game-ese известно как «глупые часы». Они первыми извлекли 14-ую улику из водохранилища Лексингтон возле Лос-Гатоса: кошелек с 25 визитками, предположительно принадлежащих Goonies персонажу Честеру Копперпоту. В течение тревожных минут они смотрят на карты.Потолок фургона — единственный источник света на многие мили.
«Игра в игру» похожа на сдачу экзамена SAT: после нескольких попыток у вас не обязательно будет больше знаний, вы просто лучше понимаете, как все работает. Некоторые криптографические методы имеют тенденцию повторяться. Игроки лучше узнают полезную информацию и отбрасывают отвлекающие факторы.Некоторые ветераны-геймеры также говорят о том, чтобы проникнуть в голову Game Control — что после нескольких подсказок они выяснили, в чем суть Игры и как далеко продвигать свои догадки.
Но с этими визитками трудно справиться. Кровь и кости расположили карты в алфавитном порядке шестью разными способами. Они концентрируются на ориентации текста. Они пытаются найти связь между именами на карточках и периодической таблицей.Ничего такого. А Game Control, стремящийся замедлить работу команд, предлагает такие же сбивающие с толку подсказки, как и сами карты. Рич предлагает зажечь карты. Никто не смеется. Кейт с характерной сосредоточенностью — единственная, кто все еще тестирует идеи в своем блокноте.
«Ненавижу утомительные подсказки среди ночи», — говорит Скотт.
«Это, безусловно, ставит под угрозу нашу позицию номер один», — говорит Крис.
Возможно, это начало самоуничтожения Blood and Bones. Или, полагаю, хотя бы небольшая драка?
«Чтобы сражаться, нужна энергия», — говорит Рико, заставляя улыбнуться.
В такие мазохистские моменты, как этот, нужно задаться вопросом: зачем беспокоиться? Чтобы не напоминать, приза нет. Это вызов ради вызова. Геймеры говорят, что дело именно в этом.
«Почти грустно, как мне нравится усердно работать всю ночь без сна, чтобы выполнять довольно много бессмысленных задач», — пишет Рико позже по электронной почте.«Это заставляет меня задуматься, как много я бы сделал, если бы так усердно работал со всем остальным в моей жизни».
Действительно, азарт геймеров сложно переоценить. Обширные веб-сайты предлагают подробные отчеты о прошедших Играх. Предлагались документальные фильмы и книги. Несколько выпускников Стэнфорда, некоторые из которых составляют Team Copper Pot, недавно создали компанию Just Passing Through, которая надеется превратить эту концепцию в реалити-шоу. Разобраться с безумной подсказкой посреди ночи — вот что важно для этого опыта.
Вернувшись в фургон, разговор переходит от визитных карточек к предстоящему воссоединению Беверли-Хиллз,
. Я выхожу на заднее сиденье. Спустя какое-то время меня разбудил оживающий фургон. С момента получения подсказки по визитке прошло три часа.Решение, жалуется Скотт, содержало «на один логический скачок слишком много». Blood and Bones пришлось расположить карты по адресам на них, расположив стопку с севера на юг вдоль шоссе 101.Затем они должны были наложить каждую карту на карту внизу, поднося ее к свету, чтобы увидеть, какая буква на нижней карте пересечена буквой «X» наверху. В этих письмах был указан их следующий пункт назначения — парк в Скоттс-Вэлли.
Это пиррова победа. Blood and Bones пришлось сделать три звонка в Game Control — болезненное признание своей невежественности для команды, которая до сих пор демонстрировала изобретательность и немного везла. Под глазами образовались мешки. Головы свешиваются над спинками сидений.Майк утверждает, что ему хочется плакать. Их выражения говорят сами за себя: сейчас 3 часа ночи, и Blood and Bones потеряли лидерство.
Награда
Победа в игре больше похожа на «победу» в игре. Поскольку Game Control не наказывает за подсказки, победа измеряется неточно. В любом случае, тех, кто первым пересечет финишную черту, не ждет ничего осязаемого. Никакой чужой земли. Девичьей руки нет. Нет эликсира бессмертия. Ничто иное, как уважение группы людей, действительно хорошо разбирающихся в логических головоломках.Для тех, кто делает вид, что не воспринимает конкуренцию всерьез, этого достаточно.
В первые дни игры команда, которая финишировала первой, получила возможность спланировать следующую игру. С точки зрения стороннего наблюдателя это кажется сомнительной честью. Разработка игры обычно занимает большую часть года. Сегодня протокол игры требует, чтобы команды добровольно выполняли эту работу. Это считается «отдачей обществу». В течение 365 дней Orange Crush проводил еженедельные собрания по планированию и жертвовал сноубордингом ради криптографии.В месяц, предшествующий мероприятию, они работали практически круглосуточно.
«Мне пришлось отказаться от многих вещей», — говорит Тереза Торрес, единственный член Orange Crush с XX хромосомой. «Я бы сказал людям:« Поговорите со мной в мае ».
Один из товарищей по команде Orange Crush потратил целый учебный квартал на создание единственной подсказки, которая включала в себя соленоидные приводы и выглядела как осьминог, кратко упомянутый в конце The Goonies. Этот проект принес ему кредит для выпускного класса MIT под названием «Необычные альтернативные устройства ввода / вывода». Во время Игры этот осьминог не получил особой любви. Ни одна команда не потратила больше часа на расшифровку излучаемых вибраций в пятибитном двоичном формате.
Один год планирования. Тридцать шесть часов бега. А потом, как свадьба, все кончено.
«Намного веселее, чем свадьба», — говорит Торрес в 1999 году.
Кровь и кости могут согласиться. Как только приближается конец этой Игры — проехали почти 300 миль — и фургон атакует поворотные дороги Лос Транкос Роуд к финишу, начинается воспоминание.Настроение явно самодовольное. Blood and Bones уже дорабатывают свою стратегию для следующей игры, запланированной на шесть месяцев позже. Они просто надеются, что это не помешает свадьбе Кейт и Майка. Это было бы непросто.
Однако эта игра не принадлежит Blood and Bones. Когда фургон подъезжает к штаб-квартире Game Control в 12:32. Воскресенье, сзади визжит еще одна команда. Рич и соперник капитан гонятся за дверью. В итоге Orange Crush присуждает ничью за третье место.Copper Pot занял второе место, опередив обе команды на 57 минут. Команда Адвил в своих гавайских рубашках, все еще аккуратно отглаженных, прибыла первой в 11:12 утра.Они все еще улыбаются.
Возврат
Все выходные большие черные тучи таились над головой, угрожая затопить празднества внизу. Только когда последняя команда подъезжает к Game Control в 7:30 в воскресенье вечером, душ прекращается.
«Бог — балбес!» Торрес кричит от благодарности.
К этому времени Блад и Кости уже вычистили и вернули фургон, взятый в первом раунде плей-офф НБА и спящий в гостиной Рича.Рико погрузился в марафонский сон на 19 часов. Крис принял душ с закрытыми глазами. Завтра они вернутся в офис, обратно в лабораторию, к своим телепрограммам и командам фэнтези-спорта. Завтра вещи, которые когда-то казались непреодолимыми — уплата налогов, стояние в очереди в DMV, — уже не будут казаться такими сложными.
После игры всегда нужно время, чтобы снова почувствовать себя нормальным. Большую часть выходных геймеры живут в альтернативной реальности.Они получают представление о том, что ветеран Брент Холман описывает как «возможность совершенства». В повседневной жизни можно встретить случайные потоки информации, не имеющей смысла. Но когда кто-то ищет смысл в Игре, он там есть.
«Вы смотрите на мир по-другому, — говорит Холман 1992 года. «Вы начинаете изучать все вокруг. Вы начинаете задаваться вопросом: где же секрет? Где та маленькая вещь, которая спрятана? »
Это случится с Кровью и костями. Им просто нужно сначала проснуться
МАРИСА МИЛАНЕС, 93 года, — учитель и писатель из Колумбии, штат Миссури.
Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
Произошла ошибка при настройке пользовательского файла cookie
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности. Если ваш браузер не принимает файлы cookie, вы не можете просматривать этот сайт.
Настройка вашего браузера для приема файлов cookie
Существует множество причин, по которым cookie не может быть установлен правильно. Ниже приведены наиболее частые причины:
- В вашем браузере отключены файлы cookie. Вам необходимо сбросить настройки своего браузера, чтобы он принимал файлы cookie, или чтобы спросить вас, хотите ли вы принимать файлы cookie.
- Ваш браузер спрашивает вас, хотите ли вы принимать файлы cookie, и вы отказались. Чтобы принять файлы cookie с этого сайта, нажмите кнопку «Назад» и примите файлы cookie.
- Ваш браузер не поддерживает файлы cookie. Если вы подозреваете это, попробуйте другой браузер.
- Дата на вашем компьютере в прошлом. Если часы вашего компьютера показывают дату до 1 января 1970 г., браузер автоматически забудет файл cookie. Чтобы исправить это, установите правильное время и дату на своем компьютере.
- Вы установили приложение, которое отслеживает или блокирует установку файлов cookie. Вы должны отключить приложение при входе в систему или проконсультироваться с системным администратором.
Почему этому сайту требуются файлы cookie?
Этот сайт использует файлы cookie для повышения производительности, запоминая, что вы вошли в систему, когда переходите со страницы на страницу. Чтобы предоставить доступ без файлов cookie потребует, чтобы сайт создавал новый сеанс для каждой посещаемой страницы, что замедляет работу системы до неприемлемого уровня.
Что сохраняется в файле cookie?
Этот сайт не хранит ничего, кроме автоматически сгенерированного идентификатора сеанса в cookie; никакая другая информация не фиксируется.
Как правило, в cookie-файлах может храниться только информация, которую вы предоставляете, или выбор, который вы делаете при посещении веб-сайта. Например, сайт не может определить ваше имя электронной почты, пока вы не введете его. Разрешение веб-сайту создавать файлы cookie не дает этому или любому другому сайту доступа к остальной части вашего компьютера, и только сайт, который создал файл cookie, может его прочитать.
Лаборатории мира объединяются против вирусного врага
Источник: Вашингтон Пост, 5 мая 2003 г.,
World’s Labs Unite Против вирусного врага
Scramble Ученые для лечения ОРВИ
Роб Штайн, Штатный писатель Washington Post
Susan Zwiers, носит скрабы, две пары резиновых перчаток и маска, брызгают крошечными струйками розового жидкость в щели на прозрачной пластиковой тарелке каждый день на работе.Каждая щель является колыбелью колонии клеток почек обезьяны. Она ждет три дня и проверяет, чтобы увидеть какие клетки были убиты новым ядовитым микробом, плавающим в жидкости.
В другой части военная лаборатория строгого режима, ученые наблюдали за тремя обезьяны. У каждого были датчики легких, сердца и температуры, а также крошечный радиоприемник. передатчик имплантирован в его тело. Затем техники капнули вирус атипичной пневмонии в два легких животных и вводили возбудитель непосредственно в кровоток третьего.Исследователи хотят увидеть, будут ли приматы развить обезьяний эквивалент новой опасной инфекции грудной клетки.
Эксперименты, проводимые проводятся в Форт-Детрик, являются частью беспрецедентной международной схватки чтобы разгадать множество секретов ртутного микроба SARS. Мировое здоровье Организация организовала более дюжины лабораторий в девяти странах в одну сеть, которая круглосуточно проводит десятки исследований, чтобы проверить уловки и уязвимости вируса.Никогда еще ученые не работали так быстро, внимательно и эффективно бороться с новым заболеванием.
В то время как эпидемия тяжелый острый респираторный синдром, кажется, берется под контроль во многих мест, эксперты общественного здравоохранения по-прежнему убеждены, что угроза далеко не устранена. В вирус все еще распространяется в Китае, и эпидемии — особенно с загадочными респираторные заболевания, такие как атипичная пневмония, — заведомо непредсказуемы. Ученые надеясь извлечь выгоду из того, что может стать перерывом в эпидемии, чтобы закрепиться грозный баг.
«Мы на «перекресток», — сказал Марк Солтер, возглавляющий медицинское нападение ВОЗ на атипичную пневмонию. нужно установить, что будет с этим заболеванием. Мы не можем угадать, и следующие шаги должны быть основаны на твердой, научно подтвержденной информации. Работа в течение следующих нескольких недель жизненно важна для установления нашего понимания как это заболевание может прижиться или нет ».
Так вирусологи, микробиологи, эпидемиологи, генетики и другие специалисты в области Соединенные Штаты, Китай, Европа, Япония, Сингапур, Канада и другие страны участвуют в гонках. найти ответы на самые фундаментальные вопросы о вирусе — ответы это определит, приручен ли вирус или разрастется.
Может ли зараза быть распространяется людьми, которые кажутся здоровыми или кажутся выздоровевшими? Если так, На сколько долго? Мутирует ли вирус в более опасную форму? Сколько вируса нужно, чтобы кто-то заболел? Как долго он сохраняется на дверных ручках и другие объекты? Может ли вакцина защитить людей? Можно ли вылечить ОРВИ? Как много жертвы умирают?
В выходные, ученые в сети сообщили о наиболее полных результатах исследований изучение того, может ли вирус выжить вне тела больного человека.Данные предполагают, что микроб может задерживаться на обычных предметах и в человеческих отходах, часами и, возможно, даже днями. Полученные данные могут объяснить, как некоторые люди могут заразиться без прямого контакта с инфицированным человеком. Им следует также помогают найти лучшие способы стерилизации загрязненных участков.
«Эти ответы будут имеет решающее значение для того, чтобы помочь нам сдержать болезнь и контролировать ее «, — сказал Клаус Стор, Ведущий ученый ВОЗ по SARS.
Еще много исследований идет полным ходом, и уже сегодня можно будет получить больше ответов.В Гонконге для Например, ученые проводят дополнительные экологические эксперименты. Они также тестировали более 200 жителей многоквартирного дома, где сотни людей загадочным образом заразились. Ученые надеются, что они будут возможность определить, какие из них, если таковые имеются, заразны, как долго и как именно.
в Сингапуре, исследователи расшифровывают генетический состав дополнительных штаммов вируса, работа, которая может помочь определить источник вируса и является ли он мутирует в более вирулентные разновидности.
На юге Китая, команды ловят и тестируют свиней, птиц и других животных в надежде узнать, есть ли у животных резервуар нового вируса это может вызвать новую вспышку.
В Ханое и Торонто, исследователи собирают подробные реконструкции вспышек в каждой города, чтобы попытаться различить любую закономерность, которая раскрыла бы, почему некоторые люди становятся заражены, а другие нет, и почему одни выживают, а другие умирают.
И в США Штатов, федеральное правительство привлекло десятки ученых, которые проведение всего спектра исследований SARS в Центрах болезней Контроль и профилактика в Атланте, Национальные институты здравоохранения в Bethesda, университеты по всей стране и даже Пентагон.
At Fort Detrick, Цвиерс и другие ученые из Медицинского научно-исследовательского института инфекционных заболеваний армии США. Болезни (USAMRIID) проводят множество исследовательских проектов, направленных на помощь в разработке более точных тестов на SARS, вакцины и лечения.
Охота за терапией пожалуй, самая напряженная работа, предполагающая просмотр десятков тысяч существующие лекарства, экспериментальные агенты, известные соединения и другие химические вещества сущности.
Месяц назад Zwiers был проводить дни в лаборатории уровня биобезопасности 3, проверяя химические вещества, чтобы увидеть смогут ли они убить вирус оспы, наиболее опасный из биологических оружие. Три обезьяны — дорогой и ценный товар в биологическом мире. исследования, также были предназначены для экспериментов с оспой.Потом наступил ОРВИ.
Эксперимент с обезьянами был разработан, чтобы определить, могут ли животные стать хорошей моделью для тестирование любых обнаруженных потенциальных лекарств. К концу прошлой недели обезьяна у которого вирус был введен в кровоток, у него началась лихорадка и начал испытывать затруднения с дыханием. Одна из других обезьян оказалась начинают проявляться симптомы.
Zwiers работает в одном из самые безопасные биологические лаборатории в мире.До того, как ей разрешили войти, ей нужно было сделать прививку от списка смертельных патогенов. После переодевшись в скраб и прогуливаясь под стерилизующим ультрафиолетом, она набирает код на клавиатуре, чтобы войти в специально запечатанный и вентилируемый объект биологического сдерживания.
Затем она надевает старую пара кроссовок, которые она держит на работе, и вводит второй код, чтобы войти ее лаборатория. Первое, что она делает, это надевает защитное снаряжение.
Каждый день в прошлом несколько недель Цвиерс измерял различные концентрации различных просеиваемых порошков, смешивали их с прозрачной жидкостью и впрыскивали в лунки размером с ластик для карандаша на прозрачной пластиковой пластине. Каждый колодец содержит клетки почек обезьяны, выращенные специально для такого рода исследований.
Zwiers затем открывает морозильник и удаляет небольшие пластиковые флаконы, содержащие коронавирус, вызывающий SARS, который USAMRIID получил от CDC почти сразу после ученых там изолировали это.Вирус имеет мутный красновато-розовый оттенок, потому что он был выращены в культуре тканей.
Zwiers затем переходит в шкаф биологической безопасности, большой металлический ящик со стеклянным экраном спереди и открытие для ее рук. Коробка имеет специальную вентиляцию, чтобы исключить вирус проникает в комнату.
После оттаивания вируса, Цвиерс разбавляет его и выливает жидкость в большую пластиковую лодку из который она набирает образцы в пипетку.
«Я особо не волнуюсь об этом, — сказал Цвиерс, микробиолог из Роквилля. — Мы все очень хорошо обучены и знают, как безопасно работать с очень патогенными вирусами. Все осведомлены о том, что мы делаем ».
После сдачи на хранение вирус в некоторые лунки, Zwiers помещает лоток в инкубатор. Три дня позже она снимет его и проведет тесты, чтобы увидеть, какие ямы еще живы. клетки.
«Это не очень часто чтобы люди работали с недавно появившимися вирусами.Это интересно видеть что-то с самого начала. Мы все вовлечены в процесс обучения «. — сказал Цвиерс.
USAMRIID проходит тестирование каждый лицензированный препарат, а также десятки тысяч других химических соединений.
«Это совершенно новый вирус. Поэтому мы применяем метод грубой силы и тестируем их все «, — сказал Джон. Хаггинс, руководитель отделения вирусной терапии в USAMRIID.
Хотя некоторые врачи в Азии сообщили, что противовирусный препарат рибавирин помог некоторым у пациентов, особенно в сочетании со стероидами, тестирование в USAMRIID не обнаружило доказательства того, что он был эффективен против вируса.
К концу последнего неделю Цвиерс и ее коллеги проверили более 40 000 соединений, включая все лицензированные противовирусные препараты, а также еще 50 связанных соединения.
«Мы видим некоторых интересные хиты. Кажется, есть некоторые соединения, которые, кажется, ингибируют вирус «, — сказал Хаггинс.
Наркотики, известные как интерфероны, например, казалось, работают, но неясно, действуют ли они эффективен в дозах, которые люди могут переносить, сказал Хаггинс.
«Мы очень надеемся найти что-то — что-то, что можно было бы использовать, чтобы быстро кого-то вылечить «, — сказал Хаггинс. «Это очень срочно, потому что мы просто не знаем достаточно. Если атипичная пневмония не исчезнет, нам придется продолжать работу. И это не так похоже, SARS уходит ».
Анализ путей обработки MHC класса I, которые вызывают ответ на поздние белки вируса осповакцины
Abstract
Использование рекомбинантных вирусных векторов, кодирующих неродные АГ, является привлекательным механизмом для создания защитных антител, CD4 + Т-клетки (T CD4 + ) и CD8 + Т-клетки (T CD8 + ) ответы in vivo после иммунизации.Однако жизненный цикл и тропизм вирусного вектора, а также его взаимодействия с различными компонентами иммунной системы должны быть полностью поняты, чтобы максимизировать эффективность любых стратегий вакцинации. Ответы Ab и T CD4 + обычно нацелены на нативные АГ, управляемые поздними промоторами в векторах на основе вируса осповакцины (VACV). Однако было продемонстрировано, что модельные Ag, управляемые поздними промоторами в рекомбинантных векторах VACV, не стимулируют ответы T CD8 + , тогда как идентичные Ag, управляемые ранними промоторами, стимулируют сильные ответы.Напротив, T CD8 + может быть образован против некоторых естественных поздних VACV Ag. Мы исследовали эту дихотомию, исследуя пути презентации Ag, ответственные за презентацию природных поздних VACV Ag у мышей. Мы обнаружили, что все исследованные нами поздние вирусы VACV могут быть перекрестно праймированы (то есть представляться неинфицированными профессиональными APC), а также напрямую представляться инфицированными популяциями дендритных клеток. Однако один Ag был представлен только профессиональными популяциями APC и не был мишенью защитного ответа T CD8 + .Следовательно, нет общей блокады в представлении Ag поздних VACV Ag, а экспрессия ненативных Ag, управляемая поздним промотором, позволяет продуцировать большие количества Ag, которые могут обеспечивать одновременное нацеливание как на T CD4 + , так и на ответы Ab, а также T CD8 + ответов, в будущем.
Введение
CD8 + Т-клетки (T CD8 + ) играют важную роль в устранении хозяином патогенов, опухолей и трансплантированных тканей.Вирус-специфичный T CD8 + может распознавать молекулы MHC класса I (MHC-I), связанные с пептидами, полученными из вирусных белков на поверхности APC (1). Эти комплексы пептид-MHC-I (p-MHC-I) могут образовываться двумя пространственно различными путями. В инфицированных вирусом клетках присутствуют пептиды, полученные в основном из подгруппы вирусных белков, которые быстро разлагаются в процессе, известном как прямая презентация (2, 3). Альтернативно, долгоживущие белковые субстраты могут быть перенесены из инфицированных вирусом клеток в профессиональные APC (pAPC), где они обрабатываются и представляются неинфицированными клетками посредством пути перекрестной презентации (4–6).Степень, в которой пути прямой или перекрестной презентации способствуют индукции вирус-специфичного T CD8 + in vivo, остается спорной (6). Многие патогены развили механизмы для модуляции или уклонения от пути прямой презентации (7), подразумевая, что такие механизмы могут давать преимущество в выживании, и, таким образом, указывая на важность пути прямой презентации. Однако обычно считается, что перекрестная презентация компенсирует, когда прямая презентация блокируется, позволяя генерировать специфический T CD8 + , нацеленный на такие патогены (8).
Оптимальный вектор вирусной вакцины будет индуцировать сильные клеточные (T CD8 + и CD4 + T-клетки [T CD4 + ]) и гуморальные (Ab) ответы на Ag, кодируемые в рекомбинантных вирусных векторах (9). Вирус осповакцины (VACV) является прототипом поксвируса, который составляет основу многих широко используемых векторов вакцин. Для индукции наиболее эффективных ответов Ab и T CD4 + после инфекции VACV обычно требуется амплификация исходного инокулята и экспрессия значительных количеств Ag (10–12).Это чаще всего приводит к распознаванию Ag, которые являются структурными белками, экспрессия которых управляется поздними промоторами VACV, хотя небольшое количество продуктов ранних генов также может быть мишенью для ответов Ab. Напротив, ответы T CD8 + лучше управляются экспрессией Ag из ранних промоторов VACV. Экспрессия модельного Ag из поздних промоторов стимулировала только слабые или неопределяемые ответы T CD8 + , тогда как идентичный Ag, управляемый ранним промотором, стимулировал сильные ответы (13).Отсутствие иммуногенности Ag, управляемое поздним промотором, имело место, несмотря на продукцию гораздо больших количеств Ag, чем из ранних промоторов, как in vitro, так и in vivo. Ряд исследований начал картировать широту ответа T CD8 + на VACV у мышей (14–19) и людей (20–22). Только два продукта позднего гена VACV (A42R и A3L) содержат иммунодоминантные эпитопы, картированные у мышей C57BL / 6 (15). Однако первоначальный скрининг также показал, что ряд субдоминантных эпитопов продуцируется поздними генами VACV, включая пептиды, производные от A19L-, A26L-, A42R-, B16R-, D13L-, E7R- и G6R (14–16).Нам было интересно узнать о механизмах, ответственных за индукцию ответа T CD8 + на естественно кодируемые поздние гены VACV, когда модельные агенты, управляемые поздними промоторами, настолько плохо индуцируют Ag-специфический T CD8 + . Поэтому мы стремились исследовать пути и клетки, которые ответственны за праймирование ответа T CD8 + на эти пептиды, производные от позднего Ag.
Антипоксвирус T CD8 + преимущественно праймируется посредством прямого пути презентации (23, 24), при этом дендритные клетки (DC), инфицированные VACV, взаимодействуют с наивным T CD8 + (25, 26) и представляют гораздо большее количество клеточной поверхности. p – MHC-I, чем неинфицированный DC (24).Неспособность Ag, управляемого поздним VACV-промотором, стимулировать ответы T CD8 + , коррелирует с абортивной in vitro инфекцией pAPC, при которой поздние Ag не продуцируются и поэтому прямая презентация невозможна (27–30). Однако в некоторых публикациях указано, что VACV может реплицироваться и распространяться после заражения APC (31), что указывает либо на то, что все поздние гены, необходимые для продуктивной репликации, могут продуцироваться в инфицированных популяциях APC, либо что некоторые популяции APC могут допускать позднюю транскрипцию гена VACV.Следовательно, существует возможность того, что иммуногенные поздние VACV Ag примированы VACV-инфицированными DC, которые непосредственно представляют Ag.
Большое количество продуктов поздних генов, которые образуются во время продуктивного инфицирования VACV, может смещать презентацию позднего Ag в сторону пути перекрестного представления, который требует высоких концентраций интактных Ag для эффективности (4, 32). Ранее нами были обнаружены доказательства того, что растворимые цитозольные, но не секретируемые поздние АГ секвестрируются в течение жизненного цикла поксвируса, предотвращая доступ к пути перекрестной презентации (33).Однако большое количество поздних белков VACV не входит в эту категорию белков, поэтому возможно, что большинство иммуногенных поздних пептидов VACV продуцируется путем перекрестной презентации.
В этой рукописи мы обнаружили, что в ряде различных типов клеток мРНК, кодирующая все исследованные иммуногенные поздние АГ, продуцировалась с обычным поздним фенотипом (т.е. экспрессия зависела от репликации ДНК). В отличие от исследований, в которых экспрессия модельных Ag управлялась ограниченным набором поздних промоторов, мы также обнаружили, что мРНК, кодирующая все исследованные иммуногенные поздние Ag, продуцируется в популяциях DC костного мозга и ex vivo.Кроме того, T CD8 + , специфичный для всех исследованных эпитопов, также может быть перекрестно праймирован неинфицированным pAPC in vivo. Кроме того, мы обнаружили примирование эпитопа T CD8 + из белка B16R, который, по-видимому, плохо представлен большинством инфицированных клеток, но который может быть перекрестно представлен или напрямую представлен pAPC с использованием механизмов, которые обычно не доступны в не-pAPC. населения. Возникновение ответа на этот эпитоп, по-видимому, представляет собой отвлекающий маневр для иммунной системы, поскольку он не способствует распознаванию инфицированных клеток и не защищает при иммунизации.Следовательно, как перекрестная презентация, так и прямая презентация могут позволить генерировать ответы T CD8 + на некоторые поздние VACV Ag, но не все эти ответы могут позволить нацеливаться на инфицированные клетки в защитном ответе.
Материалы и методы
Клетки
Все среды были приобретены у Invitrogen. HeLa, MC57G, STBKM-1 (34), L929, bm1SV (подарок от нашего коллеги из Медицинского колледжа штата Пенсильвания, доктора Т. Шелла) и клетки 293A, трансфицированные с помощью h3-D b (подарок доктора .J. Yewdell и J. Bennink из Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, Национальные институты здравоохранения, Бетезда, Мэриленд) содержались в среде DMEM, содержащей 10% FBS с добавлением пенициллина / стрептомицина и 2 мМ l-глутамина. Для создания линий клеток с двойным нокаутом LMP2 / MECL и LMP7 / MECL клетки почек от мышей с двойным нокаутом LMP2 / MECL и LMP7 / MECL трансфицировали плазмидой pSELECT-ESV, содержащей Т-Ag SV40. Трансфицированные клетки высевали в предельном разведении и собирали колонии от одной трансфицированной клетки и проверяли на положительное окрашивание Т-Ag с помощью иммунофлуоресценции.
ДК из костного мозга (BMDC) получали, как описано ранее (35).
DC изоляция
C57BL / 6 мышей инокулировали i.d. с ~ 5 × 10 5 Flt3-экспрессирующие лиганд опухолевые клетки В16. Две недели спустя селезенки от иммунизированных мышей собирали, микродиссектировали и инкубировали в 1 мг / мл коллагеназы D (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) при 37 ° C в течение 20 минут. После лизиса эритроцитов оставшиеся клетки инкубировали с PanDC MicroBeads (Miltenyi Biotec, Auburn, CA) и положительно сортировали с использованием системы AutoMACS (Miltenyi Biotec).DC были идентифицированы как CD19 — NK1.1 — CD90 — CD11c + и разделены на следующие подмножества: плазмацитоидные DC (B220 + CD11b-CD8α — ), CD11b + DC ( CD11b + CD8α — B220 — ) и CD8α + (CD8α + B220 — CD11b — ), как и ранее (24).
Вирусы
VACV (штамм WR) выращивали и титровали с использованием клеток 143B TK — , регулярно проверяемых на наличие дополнительных патогенов, как описано ранее (36).Рекомбинантный VACV (rVACV), экспрессирующий GFP, управляемый ранним / поздним промотором p7.5 (VACV-p7.5 GFP) или поздним промотором p11 (VACV-p11 GFP), был описан ранее (31). Для титрования VACV из инфицированных BMDC клетки лизировали в указанные моменты времени и титровали на клетках 142B TK —, как указано выше. Для титрования вируса эктромелии (ECTV) из инфицированных BMDC клетки лизировали и проводили титрование, как ранее (37).
Пептиды
Антигенные пептиды для иммунодоминантного раннего эпитопа VACV B8 20–27 , (TSYKFESV), поздних эпитопов VACV A3L 270–277 (KSYNYMLL), A3L 196–199 47–55 (VSLDYINTM), A26L 257–264 (SIYQYVRL), A42R 88–96 (YAPVSPIVI), B16R 275–283 (ISVANKIYM), D13L 118–126 (NC) 130–137 (STLNFNNL), G6R 77–85 (YMLENIQVM) и OVA куриного яйца 257–264 (SIINFEKL) были синтезированы Macromolecule Core Facility в Медицинском центре Херши.
Животные
Самки мышей C57BL / 6 были приобретены в лаборатории Джексона. Всех мышей содержали в определенных условиях, свободных от патогенов, в Медицинском центре им. М. С. Херши. Все исследования были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Государственного медицинского колледжа Пенсильвании.
Количественное определение РНК
Клеточные линии, BMDC или очищенные ex vivo DC (см. Выше) инфицировали VACV при MOI 10 в течение 7 ч с добавлением 40 мкг / мл AraC или без него.Затем клетки дважды промывали PBS и общую РНК экстрагировали с использованием набора RNeasy Plus Mini (Qiagen) с обработкой ДНКазой в соответствии с инструкциями производителя. Затем этот объем добавляли в спин-колонки RNeasy (заказ 74104; Qiagen) и центрифугировали при 10000 об / мин в течение 15 с. Концентрацию РНК определяли с помощью спектрофотометра с наночастицами, а затем образцы хранили при -80 ° C до использования для получения кДНК с использованием набора Applied Biosystems Reverse Transcriptase High-Capacity Kit (номер для заказа 4368814) и Labnet Multigene Thermocycler.Количественная ПЦР в реальном времени была проведена на образцах с использованием FastStart Universal Probe Master Mix (20415300; Roche). Праймеры, специфичные для гена VACV, были следующими: прямой праймер E7R 5′-TCATGCAGAGAAAAGTTCTCC-3 ‘и обратный праймер 5′-TGCCTATGCTACATGAGTTCC-3′; Прямой праймер A42R 5’-GCCGCCATCGTTGATTACAAG-3 ‘и обратный праймер 5′-ATACAGGGGCGTACCCAGTAAG-3′; Прямой праймер A26L 5’-TACAGCGGCAGTTGATAGG-3 ‘и обратный праймер 5′-TGGATGGACAGTAGGTAATGG-3′, прямой праймер A3L 5’-TGGCAATAGTGGAAGAGTGG-3 ‘и обратный праймер 5′-CGATAACAGGGGAATGAAC; Прямой праймер B8R 5’-CATTGACTGAATACGACGACC-3 ‘и обратный праймер 5′-CTCCGAATGTGAAGTTAGCC-3′; Прямой праймер G6R 5’-GTTCCAGCTCGTGTGTTC-3 ‘и обратный праймер 5′-GCACTGTTAAGTTACGTTGAGG-3′; Прямой праймер A19L 5’-AGAGTCGCAAAAAGAAGCC-3 ‘и обратный праймер 5′-GCCAGTGTATTACCCCTCATAG-3′; Прямой праймер B16R 5’-GAACCCGACACAATCAGAC-3 ‘и обратный праймер 5′-GGACATACCATTTCGCCAG-3′; и прямой праймер D13L 5’-ATACCCAACTTCACCACCC-3 ‘и обратный праймер 5′-CACCTAAAGCAGTTTTTAAGCC-3’.Образцы были обработаны с использованием термоциклера Step One (Applied Biosystems) и проанализированы с использованием программного обеспечения Excel и Prism. Изменения в экспрессии генов выражали как кратное изменение с использованием метода расчета ΔΔΔ Ct против ложно инфицированных клеток и сравнивали с амплификацией gapdh с использованием зонда Universal Probe Library №. 80 (Roche) с прямым праймером 5′-TGTCCGTCGTGGATCTGAC-3 ‘и обратным праймером 5′-CCTGCTTCACCACCTTCTTG-3’. Праймеры были от Integrated DNA Technologies.
Ag-специфические Т-клетки
мышей C57BL / 6 инфицировали 5 × 10 6 БОЕ VACV i.v., а спустя 7 дней селезенки собирали и промывали 10 мл Т-клеточной среды (RPMI 1640, 10% FCS, 1% заменимых аминокислот, 0,1% 2-ME, 15 Ед / мл человеческого IL-2, 100 ед. / мл. Ед / мл пенициллина и 100 мкг / мл стрептомицина). Всего 5% спленоцитов обрабатывали 10 -9 М синтетическими пептидами в течение 45 минут при комнатной температуре. Затем импульсные клетки промывали и добавляли к культуре селезенки в шестилуночных планшетах из расчета 5 × 10 6 клеток на лунку. Клетки получали среду Т-клеток каждые 3 дня и повторно стимулировали спленоцитами с импульсным пептидом каждые 7-8 дней.Перед использованием клетки центрифугировали над средой для разделения лимфоцитов для удаления мертвых клеток.
Окрашивание внутриклеточных цитокинов
Различные клеточные линии или BMDC были инфицированы VACV при MOI 10 в течение 7 часов с добавлением 40 мкг / мл цитозинарабинозида (AraC) или без него. Затем клетки промывали и замораживали для дальнейшего использования. Ag-специфические Т-клетки высевали в 96-луночные круглодонные планшеты из расчета 10 5 на лунку и инкубировали с таким же количеством инфицированных клеток в течение 4 ч при 37 ° C с 10 мкг / мл брефельдина А.Клетки центрифугировали при 350 × g в течение 5 минут при 4 ° C и блокировали блоком Fc с 10% сывороткой мыши в течение 15 минут. Затем клетки окрашивали антителами к CD8 при разведении 1: 100 в блоке Fc с 10% сывороткой мыши в течение 1 часа. После двух промывок PBS клетки фиксировали 3,7% формальдегидом в PBS в течение 10 мин при комнатной температуре и хранили при 4 ° C в течение ночи в HBSS-BSA. На следующий день клетки подвергали проницаемости 0,5% сапонина в блоке Fc с 10% сывороткой мыши в течение 15 минут при 4 ° C. Затем клетки окрашивали антителами против IFN-γ в соотношении 1: 100 в 0.5% сапонина в блоке FC с 10% сывороткой мыши в течение 1 ч при 4 ° C. Затем клетки дважды промывали PBS и суспендировали в 250 мкл PBS для анализа FACS.
Чтобы сравнить ответы Т-клеток на различные АГ, мы нормализовали количество Т CD8 + , продуцирующих IFN-γ в ответ на VACV-инфицированный MC57G, до количества, обнаруженного после инкубации с клетками MC57G, обработанными 10 -10 M пептидом. , который давал максимальный ответ со всеми использованными линиями за вычетом фона, который составлял <0,5% T CD8 + для всех тестируемых линий.Присутствие или отсутствие AraC или IFN-γ не влияло на активацию каких-либо линий T CD8 + в отсутствие инфекции VACV.
Ex vivo ICS
Мыши были инфицированы i.p. с 5 × 10 6 БОЕ VACV и селезенкой и перитонеальной жидкостью, собранной на 7 день после инфицирования. Клетки обрабатывали, как описано ранее, и стимулировали 10 -6 M пептидов в течение 45 минут, затем инкубировали в течение 4 часов при 37 ° C с 10 мкг / мл брефельдина A и окрашивали на IFN-γ, как описано выше.
In vivo killing assay
C57BL / 6 и Batf3 — / — реципиентных мышей были инфицированы 5 × 10 6 БОЕ VACV i.v. Через семь дней селезенки мышей-доноров B6.SJL собирали при соотношении реципиентов и мышей-доноров 3: 1. Равное количество донорских спленоцитов обрабатывали 10 –6 контрольными пептидами M (OVA 257–264 , SIINFEKL), A3L 191–199 и B16R 275–283 пептидов, соответственно, при комнатной температуре в течение 45 минут. . После двух промывок PBS спленоциты инкубировали с 0.025 мкМ (контрольная группа), 0,25 мкМ (группа A3L) и 2,5 мкМ (группа B16R) CFDA-SE при 37 ° C в течение 10 м. После двух промывок HBSS / BSA клетки вводили внутривенно. в хвостовую вену мышей-реципиентов. Селезенки собирали у мышей-реципиентов через 8 часов после инъекции и обрабатывали, как описано ранее (38-40). Клетки окрашивали анти-CD45.1 Ab и анализировали с помощью проточной цитометрии.
Кросс-презентация in vivo
Для иммунизации in vivo мышей инфицировали внутривенно. с 1 × 10 7 БОЕ VACV или были введены i.п. с клетками STBKM-1 (β 2 m neg ), которые были инфицированы VACV. STBKM-1 инфицировали VACV при MOI 10, а затем обрабатывали псораленом и УФ-светом (УФ-С), как описано ранее (36, 41).
Проба защиты
Всего 50 мкг каждого пептида растворяли в 100 мкл PBS и тщательно перемешивали со 100 мкл IFA и 0,5% (мас. / Об.) BSA. Смесь вводили п / к. в мышей дважды с интервалом в 1 неделю. Через четырнадцать дней мышам интраназально вводили 2 × 10 6 БОЕ VACV.За зараженными мышами ежедневно наблюдали признаки заболевания (вялость, взъерошенность волос, потеря веса, кожная сыпь, выделения из глаз) и неминуемой смерти (невосприимчивость к прикосновениям, отсутствие произвольных движений).
Анализ данных
Данные были проанализированы и построены в виде графиков с помощью Excel (Microsoft) и Prism (GraphPad). Данные выражены в виде среднего значения ± планки ошибок, которые представляют собой SEM. Средние значения сравнивали с использованием непарного двустороннего теста Стьюдента t или двустороннего дисперсионного анализа, в зависимости от ситуации. Данные представляют не менее трех отдельных экспериментов.Значимость между группами определялась значением p <0,05 и отображается как * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001 и **** p <0,0001 .
Результаты
Поздние генные продукты являются антигенными и иммуногенными по отношению к T
CD8 +Ряд иммуногенных пептидов, ограниченных MHC-I, был идентифицирован в генах VACV, которые классифицируются как поздние гены. Примечательно, что презентация Ag инфицированными вирусом клетками (прямая презентация) чаще всего использует недавно синтезированный, быстро разлагающийся Ag, который может быть неправильно свернут, в качестве субстрата для производства иммуногенных пептидов (3, 34, 42, 43).Следовательно, уровни мРНК, из которых могут быть получены эти субстраты, более важны для презентации Ag, чем уровни интактного правильно свернутого белка, который они также могут генерировать. Уровень транскрипта мРНК каждого из этих поздних иммуногенных генов был ранее исследован на клетках HeLa, линии карциномы шейки матки человека (44–47). Поскольку наши исследования включали изучение иммуногенности этих генных продуктов у мышей, мы стремились расширить характеристику временной природы транскрипции этих генов на мышиные клетки, клетки L929 (линия фибробластов соединительной ткани мыши) и STBKM. -1 (линия фибробластов печени мыши, трансформированная SV40).Сначала мы исследовали уровни мРНК каждого гена относительно гена домашнего хозяйства (GAPDH) после инфицирования клеток STBKM-1 с помощью полуколичественной ПЦР. Мы обнаружили широкий диапазон уровней мРНК через 6 часов после инфицирования, аналогичный тому, который наблюдал Yang et al. (45–47) (рис. 1A). РНК, кодирующая шесть продуктов поздних генов, содержащих иммуногенные пептидные последовательности, присутствовала на уровнях примерно на 3 log выше, чем оставшиеся два иммуногенных поздних белка VACV, что позволяет классифицировать гены на «высоко» и «низко» экспрессируемые (рис.1А). Уровни мРНК, продуцируемой высокоэкспрессируемыми генами, были подобны или превышали уровни мРНК из продукта раннего гена VACV B8R, содержащего иммунодоминантный пептид (фиг. 1A). Мы стремились установить, соответствует ли экспрессия в наших трех типах клеток аналогичным временным требованиям во время репликации VACV, поэтому мы инфицировали клетки HeLa, L929 или STBKM-1 в течение 6 часов в присутствии или в отсутствие AraC. AraC блокирует репликацию ДНК и, таким образом, завершение репликативного цикла VACV, что, в свою очередь, нарушает позднюю экспрессию Ag.Мы обнаружили аналогичную чувствительность к AraC во всех исследованных типах клеток, но продукция мРНК некоторыми генами была намного менее чувствительна к ингибированию AraC, чем другие (рис. 1B). Примечательно, что G6R был преимущественно нечувствителен к ингибированию AraC, а экспрессия A3L, A26L, B16R и D13L ингибировалась AraC только на ~ 60% (фиг. 1B).
РИСУНОК 1.Поздние гены VACV генерируют ответы CD8 + .
( A ) Относительные уровни транскриптов каждого продукта гена VACV, который является источником одного или нескольких иммуногенных пептидов, ограниченных MHC-I, через 6 часов после инфицирования клеток STBKM-1.( B ) Ингибирование экспрессии каждого транскрипта иммуногенного продукта позднего гена VACV в присутствии AraC в клетках HeLa человека или клетках мыши STBKM-1 или клетках L929. Графики аннотированы уровнями выражений из (A). ( C ) Мышей инфицировали VACV, и спустя 7 дней спленоциты собирали, подвергали воздействию указанных пептидов и через 6 часов окрашивали для выявления внутриклеточной продукции IFN-γ. Фоновый уровень активации T CD8 + в присутствии пептида или контрольного пептида (воспроизводимый 0.1–0,15% IFN + T CD8 + ) повсюду вычитали. Величина ответа T CD8 + аннотирована относительно уровней транскриптов из (A).
Затем мы исследовали степень первичного ответа T CD8 + на каждый пептид путем иммунизации мышей VACV i.v. и 7d позже исследуют способность селезенки T CD8 + продуцировать IFN-γ в ответ на стимуляцию in vitro каждым пептидом. Как и ожидалось, ответ на иммунодоминантный ранне-поздний пептид B8R был намного выше (∼8.5% селезенки T CD8 + ), чем пептиды, происходящие из любого из продуктов позднего гена, только с одним пептидом из A3L (A3L 270–277 ∼2,9%), что дает ответ, превышающий 1% селезенки. Т CD8 + (рис. 1В). Из оставшихся пептидов большинство воспроизводимо превышало фон (который был вычтен), хотя пептиды G6R 77–85 и A19L 47–55 вызывали очень слабые ответы (рис. 1C). Следовательно, репликация ДНК требовалась для полной или частичной экспрессии ряда продуктов генов, которые были мишенями для ответов T CD8 + в первичном ответе против VACV.
Не все иммуногенные поздние пептиды являются антигенными in vitro
Мы ранее описывали блокаду в представлении, которая коррелировала со сниженной иммуногенностью некоторых поздних АГ (33). Поэтому мы изначально стремились изучить презентацию иммуногенных поздних пептидов инфицированными клетками in vitro. Чтобы облегчить измерение презентации Ag, мы создали краткосрочные поликлональные Т-клеточные линии, специфичные для B8R 20–27 , A3L 191–199 , A3L 270–277 , A26L 257–264 , B16R 275–283 и A42R 88–96 пептидов.Мы подтвердили, что все эти клетки ответили на пептиды в низком пикомолярном диапазоне, а затем проанализировали продукцию IFN-γ после контакта с инфицированными клетками. Мы действительно пытались сгенерировать клеточные линии, специфичные для других поздних эпитопов VACV (таких как эпитоп из D13L), но полученные нами клеточные линии имели низкую аффинность и в результате, вероятно, дали вводящие в заблуждение отрицательные результаты. Поэтому мы продвинулись вперед с нашими линиями высокоаффинных Т-клеток.
Мы инфицировали клетки MC57G, линию фибросаркомы h3 b , VACV, добавляли Т-клетки через 4 часа после инфицирования, затем фиксировали и анализировали продукцию IFN-γ еще через 6 часов.Это должно дать достаточно времени для презентации продуктов поздних генов, все из которых транскрибируются через 6 часов после инфицирования (рис. 1А). Чтобы сравнить ответы Т-клеток на различные АГ, мы нормализовали количество Т CD8 + , продуцирующих IFN-γ в ответ на VACV-инфицированный MC57G, до количества, обнаруженного после инкубации с клетками MC57G, обработанными 10 -10 M пептидом, который дал максимальный отклик на все использованные строки. Презентация контрольного пептида B8R, а также пептидов A3L 191–199 и A3L 270–277 была эквивалентна максимальному ответу на импульсные пептиды клетки MC57G (рис.2А). Ответ на пептид A42R 88–96 , представленный инфицированными клетками, достигал лишь ∼75% ответа на экзогенный пептид, а пептид A26L 257–264 еще менее эффективно презентовался инфицированными клетками (∼34% от 10 ). -10 M экзогенного пептида) (рис. 2А). Ответ Т-клеток на все поздние АГ, но не на ранний контроль B8R, был снижен обработкой AraC (рис. 2А), аналогично уровням мРНК (рис. 1А), что указывает на то, что репликация ДНК, вероятно, по крайней мере частично необходима для Производство Ag и последующая презентация.Однако, хотя транскрипция продукта гена B16R была легко обнаружена в VACV-инфицированных клетках (рис. 1A), мы не смогли обнаружить презентацию ограниченного h3-D b пептида B16R 275–283 (рис. 2A). ). Чтобы гарантировать, что неспособность измерить презентацию пептида B16R 275–283 не была наблюдением, ограниченным клетками MC57G, мы исследовали презентацию в дополнительных клеточных линиях, а именно в клеточной линии, полученной от мышей bm13, в которой h3-D b является единственным экспрессируемым функциональным классом MHC, а линия 293 эмбриональных клеток человека трансфицирована h3-D b .В этих клеточных линиях, инфицированных VACV, рестриктированные пептиды h3-K b (B8R 20–27 , A3L 270–277 и A26L 257–264 ) не были представлены, но активация A3L 191–199 — и A42R 88–96 –специфическая линия Т-клеток была аналогична той, что наблюдалась у VACV-инфицированного MC57G (рис. 2B, 2C). Однако, подобно MC57G, пептид B16R 275–283 не был представлен VACV-инфицированными клетками bm13SV или 293-D b (рис. 2B, 2C). Таким образом, несмотря на свою иммуногенность in vivo (рис.1C), по-видимому, существует общий дефицит в презентации пептида B16R 275–283 VACV-инфицированными клетками.
РИСУНОК 2.Не все иммуногенные поздние гены VACV представлены инфицированными клетками.
Высокоаффинные линии T CD8 + были созданы против B8R 20–27 , B16R 275–283 , A3L 191–199 , A3L 270–277 , A26L 257–264 и Пептиды A42R 88–96 . Для количественной оценки презентации Ag каждого из этих пептидов VACV-инфицированными клетками мы инфицировали MC57G ( A ), Kbm1SV ( B ) или 293-D b ( C ) VACV в течение 4 часов, затем инкубировали с каждой линией T CD8 + и определяли количество T CD8 + , продуцирующих IFN-γ в ответ на VACV, по сравнению с количеством, продуцирующим IFN-γ в ответ на 10 -10 M специфического пептида.Фоновый уровень активации T CD8 + в присутствии пептида или контрольного пептида (воспроизводимый 0,1-0,15% IFN + T CD8 + ) вычитали. Графики аннотированы подробностями молекулы MHC (h3-K b или h3-D b ), которая представляет соответствующие пептиды. Значимость между выбранными группами отображается как *** p <0,001.
Лечение IFN частично восстанавливает представление B16R, независимо от иммунопротеасомы
При рассмотрении отсутствия антигенности in vitro пептида, который является иммуногенным in vivo, мы пришли к выводу, что воспалительная среда после поксвирусной инфекции может допускать воздействие на клетки цитокинов, которые активировать презентацию пептида B16R 275–283 .Хорошо известно, что воздействие IFN на клетки, особенно IFN-γ, может активировать ряд компонентов пути процессинга Ag, включая комплекс транспортера TAP и экспрессию субъединиц иммунопротеасомы (48). Поэтому мы инкубировали клетки MC57G с IFN-γ в течение ночи и исследовали презентацию пептидов A3L 270–277 , A42R 88–96 и B16R 275–283 поздних VACV, а также контрольного B8R 20– 27 пептид. IFN-γ не увеличивал презентацию пептидов A3L 270–277 , A42R 88–96 и B8R 20–27 в статистически значимой степени, вероятно, потому, что презентация уже была максимальной в используемых условиях (рис.3А). Однако предварительная обработка IFN-γ позволила измерить презентацию пептида B16R 275–283 , хотя и на уровнях, которые все еще были намного ниже, чем активация отвечающих Т-клеток на экзогенный пептид 10 −10 M (рис. 3A). .
РИСУНОК 3. ОбработкаIFN позволяет распознавать детерминанту B16R на инфицированных клетках независимо от функции иммунопротеасомы.
( A ) Клетки MC57G инкубировали в течение ночи в присутствии или в отсутствие IFN-γ, затем инфицировали VACV в течение 4 часов, после чего высокоаффинные линии T CD8 + для контроля B8R 20–27 или пептиды, полученные из позднего белка VACV, B16R 275–283 , A3L 191–199 или A42R 88–96 , добавляли еще на 4 часа.Количество T CD8 + , продуцирующее IFN-γ в ответ на VACV, определяли количественно относительно количества, продуцирующего IFN-γ в ответ на 10 -10 M специфического пептида. ( B ) Клетки KBM1SV или клетки LMP2 / 7dkoSV инкубировали в течение ночи в присутствии или в отсутствие IFN-γ, затем инфицировали VACV в течение 4 часов, после чего линии T CD8 + с высоким сродством к позднему белку VACV — производное B16R 275–283 или A3L 191–199 добавляли еще на 4 часа.Количество T CD8 + , продуцирующее IFN-γ в ответ на VACV, определяли количественно относительно количества, продуцирующего IFN-γ в ответ на 10 -10 M специфического пептида. Значимость между выбранными группами отображается как * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
Представление всех других поздних пептидов VACV показало, что основные компоненты пути процессинга MHC-I, которые изменяются IFN-γ (такие как комплекс TAP или сами молекулы MHC), не ограничивают представление B16R 275 –283 пептид.Однако включение субъединиц иммунопротеасомы LMP2, LMP7 и MECL-1, экспрессия каждой из которых повышается с помощью IFN-γ, может изменять протеолиз и изменять презентацию пептид-специфическим образом (48, 49). Поэтому мы исследовали, облегчается ли усиленная презентация B16R 275–283 , опосредованная IFN-γ, действием иммунопротеасомы. Для этого мы иммортализовали фибробласты из печени мышей, лишенных иммунопротеасомных субъединиц LMP2 и LMP7, чтобы получить стабильную клеточную линию (LMP2 / 7dkoSV).Эти клетки также не смогут включать MECL-1, поскольку включение LMP7 необходимо для последующего включения MECL-1 (50). На активацию T CD8 + , специфичного для пептида A3L 191–199 , не влиял ни IFN-γ, ни отсутствие иммунопротеасомы (рис. 3B). Как указано выше, предварительная обработка IFN-γ требовалась для облегчения презентации пептида B16R 275–283 , но это усиление не изменилось в клетках, лишенных иммунопротеасомы (фиг. 3B). Следовательно, воспалительные сигналы могут позволить презентацию пептида B16R 275–283 , но это происходит независимо от иммунопротеасомы.
Поздние гены экспрессируются и представлены DC
Считается, что инициация первичного ответа T CD8 + на VACV включает презентацию Ag VACV-инфицированными DC (23, 25, 26). DC могут обладать способностью представлять пептиды, которые обычно не представлены другими типами клеток (51), поэтому возможно, что иммуногенность продуктов поздних генов VACV, включая B16R 275–283 , может быть результатом презентации DC in vivo. . Однако сообщалось, что поздние гены VACV не экспрессируются в популяциях DC (27–29, 33).Мы исследовали, можем ли мы воспроизвести блокаду продукции поздних генов в DC, используя rVACV, экспрессирующий репортер GFP, управляемый наиболее широко используемыми ранними / поздними или поздними промоторами, а именно ранним / поздним промотором p7.5 и строгим промотором позднего p11 (13 , 27). Мы увеличили первичные популяции DC in vivo, обработав мышей flt3L, как ранее (24), затем очистили объемные DC из селезенки и инфицировали VACV или rVACV, экспрессирующими GFP, управляемыми промоторами p7.5 или p11. Затем мы проанализировали флуоресценцию GFP в основных подмножествах ДК селезенки, а именно плазмацитоидных ДК, CD11b + ДК или CD8α + ДК.Мы обнаружили, как ранее опубликовано, что DC всех подмножеств экспрессировали GFP, управляемый промотором p7.5 (рис. 4A), но что флуоресценция GFP во всех подмножествах DC, инфицированных rVACV, в которых GFP управлялась промотором p11, была неотличима от неинфицированные контроли или DC, инфицированные VACV, которые не экспрессировали GFP (фиг. 4A).
РИСУНОК 4.Экспрессия поздних генов VACV и последующая прямая презентация инфицированными DC.
( A ) DC селезенки очищали от мышей, обработанных flt3L, и инфицировали VACV, VACV-p7.5 GFP или VACV-p11 GFP в течение 5 ч, затем флуоресценцию GFP измеряли в каждой подгруппе DC методом проточной цитометрии. Ингибирование экспрессии транскриптов мРНК от каждого иммуногенного позднего гена VACV в присутствии AraC в BMDC ( B ) или в DC, только что выделенных от мышей ( C ). ( D ) BMDC инфицировали либо VACV, либо ECTV при MOI 0,1. Клетки собирали в указанные моменты времени и титры VACV по сравнению с ECTV количественно определяли с помощью анализа бляшек на клетках 143B (VACV) или Vero (ECTV).( E — I ) Клетки MC57G, BMDC или DC, недавно очищенные от спленоцитов с использованием гранул pan-DC (pan DC), инфицировали VACV в течение 4 ч, после чего линии T CD8 + с высоким сродством для поздний полученный из белка VACV A3L 191–199 (E), B16R 275–283 (F), A26L 257–264 (G), A42R 88–96 (H) или A3L 270 –277 (I) добавляли еще 4 часа. Количество T CD8 + , продуцирующее IFN-γ в ответ на VACV, определяли количественно относительно количества, продуцирующего IFN-γ в ответ на 10 -10 M специфического пептида, импульсного воздействия на клетки MC57G.Значимость между выбранными группами отображается как * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
Чтобы изучить транскрипцию природных иммуногенных продуктов поздних генов, мы выполнили анализ, аналогичный описанному выше (рис. 1А). Первоначально мы инфицировали первичные популяции DC, выращенные из костного мозга в GM-CSF (BMDC), и проанализировали относительные уровни мРНК поздних генов в присутствии или отсутствии AraC, как показано на рис. 1. Мы обнаружили, что мРНК, кодирующая все иммуногенные поздние эпитопы продуцировались в BMDC и были частично (A3L, A26L и B16R) или полностью (A19L и A42R) чувствительными к ингибированию AraC, тогда как на ранний транскрипт B8R не влиял AraC (рис.4Б). BMDC может неточно отражать биологию или разнообразие популяций DC, генерируемых естественным путем у мышей (52, 53), поэтому мы выполнили выделение пан-DC непосредственно у мышей, обработанных flt3L, инфицированных VACV в течение 6 часов, и снова проанализировали уровни мРНК, продуцируемой поздним иммуногенным геном. продукты. Как и в случае с BMDC, мРНК из всех иммуногенных поздних генов продуцировалась в инфицированных популяциях ex vivo DC частично или полностью AraC-чувствительным образом (фиг. 4C). Это повысило вероятность того, что предыдущие исследования экспрессии поздних генов в популяциях DC дали вводящие в заблуждение результаты, потенциально за счет анализа неродных генов, управляемых только небольшим количеством поздних промоторов, таких как p7.Промоторы 5 и p11. Поэтому мы исследовали способность VACV реплицироваться и распространяться из BMDC путем заражения ограничивающим MOI. Затем мы собирали клетки в течение следующих 72 часов, чтобы изучить многоступенчатую кривую роста, на которой репликация происходит внутри первоначально инфицированных клеток, потомство вируса распространяется на новые клетки-мишени и измеряется репликация в этих клетках. Мы сравнили репликацию VACV с репликацией патогенного поксвируса мышей, ECTV, который, как известно, реплицируется в популяциях миелоидных клеток, что способствует его быстрому распространению среди инфицированного хозяина (54).В соответствии с этим титры ECTV в инфицированной культуре BMDC неуклонно увеличивались в течение 72 часов после заражения (фиг. 4D). Однако титры VACV не увеличивались по сравнению с уровнями входящего вируса (рис. 4D), что указывает на то, что полный репликативный цикл не завершен или происходит очень неэффективно. Следовательно, VACV, вероятно, действительно экспрессирует некоторые продукты поздних генов в популяциях DC, но есть блокада в полном репликативном цикле в еще неопределенной точке.
Как описано выше, DC обладают способностью представлять некоторые вирусные пептиды, которые обычно не представлены другими клетками.Поэтому мы исследовали, обладают ли инфицированные DC способностью представлять каждый из поздних пептидов, рассмотренных на фиг. 2, все из которых, по-видимому, экспрессируются VACV-инфицированными DC (фиг. 4B, 4C). Мы сравнили презентацию пептидов A3L 191–199 , B16R 275–283 , A26L 257–264 , A42R 88–96 и A3L 270–277 клетками MC57G, BMDC или ex vivo. изолированный селезеночный DC (рис. 4E – I). Как и ожидалось, большинство поздних генов VACV, включая пептиды A3L 191–199 , A26L 257–264 , A42R 88–96 и A3L 270–27 , были хорошо представлены всеми типами клеток. при этом наивысший или равный наивысший уровень активации специфического T CD8 + достигается VACV-инфицированными клетками MC57G (рис.4E, 4G – I). Напротив, инфицированные VACV клетки MC57G не представляли пептид B16R 275–283 , но инфицированные BMDC или ex vivo DC действительно активировали часть B16R 275–283 -специфического T CD8 + (рис. 4F). Следовательно, продукты поздних генов обычно экспрессируются DC. Кроме того, DC также могут быть специализированы для прямого представления пептидов, полученных из этих продуктов поздних генов, которые обычно не представлены другими инфицированными клетками.
Все изученные поздние гены подвергнуты перекрестному праймированию in vivo
Как указано выше, обычно считается, что ответ T CD8 + на VACV инициируется через презентацию Ag инфицированными DC (23, 25, 26, 55).Однако в этих исследованиях изучали только T CD8 + , специфичный для ранних Ag, поэтому возможно, что праймирование T CD8 + , специфичного для поздних Ag, использует другой механизм. Перекрестный прайминг (то есть презентация неинфицированным pAPC) может быть основным механизмом индукции T CD8 + в основанный на VACV нереплицирующийся вирусный вектор, модифицированный вирус Анкара (56). Кроме того, рецептор DC CLEC9A может потребоваться для поглощения VACV Ag во время перекрестной презентации и индукции ответа T CD8 + in vivo (57, 58).Поэтому мы исследовали, могут ли иммуногенные агенты позднего VACV индуцировать ответ T CD8 + после перекрестного прайминга in vivo. Мы инфицировали линию клеток STBKM-1, в которой отсутствует β2-микрогобулин и, следовательно, не может представлять Ag напрямую, с помощью VACV в течение 6 часов, достаточного момента времени для детектируемой продукции всех исследованных поздних Ag (рис. 1A). Как и ранее (36, 41), мы затем заблокировали дальнейшую репликацию VACV с помощью УФ-обработки псораленом, чтобы предотвратить потенциально затрудняющее распространение вируса для заражения клеток-хозяев.Мы сравнили способность клеток STBKM-1, инфицированных VACV в течение 6 часов и прямого заражения VACV, индуцировать T CD8 + , специфичный для контрольного раннего пептида B8R 20–27 или репрезентативных поздних пептидов B16R 275–283 , A3L 191–199 или A26L 257–264 . В каждом случае иммунизация VACV-инфицированными клетками STBKM-1 генерировала такое же количество Ag-специфических T CD8 + , что и инфекция живым вирусом, что указывает на то, что все протестированные пептиды могут перекрестно праймировать ответ T CD8 + (фиг. .5А). Чтобы оценить, влияет ли способность пептидов, происходящих из поздних белков, к перекрестному праймированию, на их способность примировать ответ T CD8 + после естественного инфицирования in vivo, мы инфицировали мышей, лишенных фактора транскрипции Batf3. У мышей Batf3 — / — отсутствует подмножество DC CX3CR1 + CD8 + , которое отвечает за кросс-прайминг, и у этих мышей наблюдается блокада кросс-прайминга Ags, кодируемых поксвирусом (59). Мы заразили мышей дикого типа (WT) или мышей Batf3 — / — и измерили ответ T CD8 + , используя наиболее чувствительный метод, а именно клиренс спленоцитов-мишеней, меченных импульсным пептидом CFSE, в анализе уничтожения in vivo (38). .На мишени, меченные CFSE, вводили импульсы A3L 191–199 или B16R 275–283 , вводили VACV-инфицированным мышам WT или Batf3 — / — через 5 дней после инфицирования, и клиренс из селезенки оценивался через 16 часов после инъекции. по сравнению с контрольными непульсируемыми целями. Мы обнаружили измеримый клиренс как A3L 191–199, — и B16R 275–283 — импульсных мишеней у мышей WT, инфицированных VACV (рис. 5B), но не было значительной разницы в клиренсе любого набора клетки-мишени между неинфицированными и инфицированными Batf3 — / — (рис.5Б). Таким образом, представляется, что присутствие CX3CR1 + CD8 + DC необходимо для индукции цитотоксического ответа T CD8 + на продукты поздних генов, экспрессируемые VACV, возможно, благодаря их способности перекрестно представлять вирусные белки.
РИСУНОК 5.Перекрестная презентация поздних генных продуктов VACV in vivo.
Клетки( A ) STBKM-1, в которых отсутствует β 2 m, инфицировали VACV в течение 6 часов, затем обрабатывали УФ и псораленом для инактивации экспрессии гена и предотвращения распространения вируса.Затем мышей WT иммунизировали 5 × 10 6 полученных в результате VACV-инфицированных клеток, и спустя 7 дней индукцию T CD8 + -ответа оценивали по сравнению с иммунизацией VACV путем воздействия на спленоциты показанных пептидов и измерения внутриклеточной продукции IFN-γ через 6 часов. ( B ) Мышей WT или Batf3ko инфицировали VACV. Пять дней спустя были введены CFSE-меченные, которые были неимпульсными или импульсными с пептидами A3L 191–199 или B16R 275–283 i.v. Через шестнадцать часов после инъекции селезенки мышей собирали и оценивали клиренс импульсных или неимпульсных пептидных клеток в анализе уничтожения in vivo. Значимость между выбранными группами отображается как * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001.
Антигенность, но не иммуногенность, является предиктором защитных возможностей
Наконец, мы попытались изучить, может ли ответ T CD8 + на пептиды, полученные из продуктов позднего гена VACV, опосредовать защитный ответ против VACV.Мы иммунизировали мышей пептидами A3L 191–199 , B16R 275–283 , B8R 20–27 или A42R 88–96 дважды, затем заражали группы из пяти мышей 2 × 10 6 PFU VACV интраназально. Все мыши, инокулированные HBSS, не содержащим пептида, быстро теряли в весе и погибали от инфекции (фиг. 6). Напротив, мыши, иммунизированные контрольным пептидом B8R 20–27 или A3L 191–199 или A42R 88–96 из поздних белков, первоначально теряли вес, но зараженные мыши перестали терять вес на 6 день постинфекции и все выздоровел.Однако мыши, иммунизированные пептидом B16R 275–283 , очень напоминали мышей, инокулированных только HBSS, быстро теряя вес и погибая от инфекции. Следовательно, хотя продукты поздних генов VACV могут продуцировать эпитопы T CD8 + , защитный эффект T CD8 + , вероятно, требует презентации всеми типами инфицированных клеток.
РИСУНОК 6.Пептидная иммунизация показывает, что антигенность, но не иммуногенность, является предиктором защитных возможностей.
Пять мышей на группу были привиты HBSS или иммунизированы пептидами A3L 191–199 , B16R 275–283 , B8R 20–27 или A42R 88–96 пептидами в IFA дважды с интервалом 7 дней .Через четырнадцать дней мышам интраназально вводили 2 × 10 6 БОЕ VACV, мышей взвешивали ежедневно в течение 15 дней и умерщвляющих мышей умерщвляли. Значимость между выбранными группами отображается как *** p <0,001.
Обсуждение
Наша работа в этом исследовании исследует механизмы, лежащие в основе дихотомии, согласно которой модели Ags, управляемые поздними промоторами VACV в рекомбинантных вирусах, не являются иммуногенными в компартменте T CD8 + , но что некоторые природные белки VACV, управляемые поздними промоторами, действительно производят Ag-специфический T CD8 + ответов.Сначала мы исследовали уровни мРНК поздних интересующих генов и обнаружили профили экспрессии, аналогичные описанным другими (44–47). Однако мы расширили предыдущие опубликованные исследования, которые проводились исключительно на клетках HeLa, чтобы изучить экспрессию в ряде других типов клеток, включая первичные популяции DC. Мы были несколько удивлены тем, что профили экспрессии во всех исследованных типах клеток были сходными, это открытие указывает на то, что клеточные компоненты, вероятно, не контролируют экспрессию иммуногенных поздних VACV Ag, из которых представлены эпитопы T CD8 + .Как продукция мРНК, так и презентация всех поздних эпитопов, происходящих от Ag, по крайней мере частично зависели от репликации ДНК, что измерялось по ингибированию с помощью AraC. Наблюдаемая нами частичная чувствительность к AraC была аналогична предыдущим исследованиям (44–47) и, вероятно, отражает истинный «поздний» или «пострепликативный» фенотип, который частично улучшается сквозной транскрипцией из ранних генов, расположенных выше генома VACV ( 45–47). Тем не менее, мы обнаружили, что все иммуногенные гены ведут себя как поздние гены, независимо от типа инфицированных клеток, включая первичные DC.
Отсутствие иммуногенности в компартменте T CD8 + первоначально коррелировало с отсутствием экспрессии управляемого поздним промотором Ag в популяциях DC (27). VACV плохо реплицируется в популяциях миелоидных клеток, особенно в макрофагах (30) и DC (27), и инфекция нарушает созревание DC (29, 60–62). Однако в предыдущих исследованиях продукции Ag, управляемой поздними промоторами, в DC изучались только модельные Ag, управляемые небольшим количеством поздних промоторов, в том числе ни один из промоторов, исследованных в этом исследовании, в rVACV (27).Следовательно, наш вывод о том, что транскрипция всех исследованных иммуногенных поздних генов происходила в DC, может быть объяснена исключительно выбором промотора, с промоторами, которые управляют иммуногенными пептидами, избирательно активными в DC, тогда как другие могут не быть. VACV не реплицировался в DC, что указывает на то, что маловероятно, что все поздние промоторы активны в DC, что согласуется с исходными данными. Однако родственный поксвирус ECTV действительно эффективно реплицировался в DC, что согласуется с открытием, что миелоидные клетки являются резервуарами инфекции ECTV, которая может быстро распространять вирус по телу (54).Действительно, дифференциальная способность ECTV к репликации в популяциях миелоидных клеток может в первую очередь объяснять его заметно повышенную летальность для мышей по сравнению с инфекцией VACV, которая обычно не является летальной для мышей. Механизмы, вызывающие блокаду продукции некоторых поздних генов VACV в популяциях DC мышей, остаются неизвестными, но могут включать экспрессию факторов хозяина, таких как SAMHD1, в неделящихся популяциях миелоидных клеток (63).
Мы обнаружили ~ 5000-кратный диапазон уровней поздних транскриптов VACV, продуцируемых в инфицированных клетках, при этом гены A19L и G6R продуцируются на низких уровнях через 6 часов после инфицирования.Примечательно, что оба эти гена продуцировали количество Т CD8 + , продуцирующее IFN-γ, которое было чуть выше фона и было самым низким из наблюдаемых ответов. Абсолютные уровни транскрипции, вероятно, не определяют эффективность прямой презентации, поскольку даже неопределяемые уровни белка Ag могут продуцировать достаточные количества поверхностного p – MHC-I для облегчения распознавания T CD8 + . Однако для перекрестной презентации обычно требуются большие количества долгоживущего Ag в качестве субстрата для индукции ответа T CD8 + , поэтому снижение иммуногенности белков, которые плохо экспрессируются, может указывать на роль перекрестной презентации в праймировании иммуногенного позднего VACV. Эпитопы, производные от Ag.
Мы ранее публиковали, что некоторым растворимым поздним VACV Ag предотвращается попадание в путь перекрестной презентации in vivo после секвестрации на фабриках VACV. Однако большинство иммуногенных поздних генов VACV, исследованных в этом исследовании, содержат N-концевые сигнальные последовательности или гидрофобные трансмембранные домены и являются компонентами внутриклеточного зрелого вируса, вируса с внутриклеточной оболочкой или мембран вируса с внеклеточной оболочкой, которые покидают вирусные фабрики.Остальные эпитопы, картированные в продуктах поздних генов VACV, находятся внутри белков, которые связываются с другими белками VACV [например, A10L связывается с A4L (64)], чтобы облегчить их выход из фабрик. Таким образом, наш вывод о том, что все исследованные иммуногенные агенты позднего VACV могут быть подвергнуты перекрестному праймированию, неудивителен. Однако мы также попытались определить степень, в которой перекрестная презентация требуется для индукции ответа T CD8 + на каждый из этих поздних Ag.
В настоящее время не существует однозначного способа различить использование прямого и перекрестного пути презентации во время инициации ответа антипоксвируса T CD8 + in vivo.Системное введение лигандов TLR было предложено как способ специфически блокировать перекрестную презентацию in vivo во время вирусной инфекции, но мы и другие продемонстрировали, что это также оказывает сильное влияние на репликацию, патогенез и прямую презентацию поксвируса (24, 65). Таким образом, мы использовали Batf3 — / — мышей, у которых отсутствует субпредставитель DC (59), чтобы попытаться различить прямой и перекрестно презентируемый Ag. Ранее мы показали, что у этих мышей не происходит перекрестного праймирования Ags, кодируемых поксвирусом, но у них нет генерализованного дефекта в ответах T CD8 + на ECTV (24).Несмотря на то, что нет общего дефекта в ответах T CD8 + , некоторые индивидуальные ответы T CD8 + могут быть снижены у мышей Batf3 — / — по сравнению с мышами WT (24). Примечательно, что мы обнаружили, что на основной B8R-специфический ответ антипоксвируса не влияет дефицит кросс-презентирующих DC, что согласуется с основной ролью прямой презентации в праймировании поксвирус-специфичного T CD8 + (24). Однако мы также обнаружили, что ответ на эпитоп A3L 270–277 из продукта позднего гена был снижен у мышей Batf3 — / — (24).Это может указывать на то, что A3L 270–277 является продуктом перекрестной презентации in vivo, и ясно, что эта детерминанта, наряду со всеми другими исследованными поздними эпитопами VACV, может быть перекрестно представлена из VACV-инфицированных донорских клеток. in vivo. Однако столь же вероятно, что инфекция Batf3-зависимого DC необходима для индукции T CD8 + ответов на поздние VACV Ag. Ранее мы описали преимущественное инфицирование MIDC-8 + DC после кожной инфекции VACV (25), а другие обнаружили инфицирование популяций CD8 — и CD8 + DC (55, 60, 66), из которых a подмножество, как известно, представляет собой подмножество перекрестного представления CX3CR1 + CD8 + (67).CD8 + DC были описаны как основная популяция APC после инфицирования VACV (68), а CX3CR1 + DC являются важными медиаторами защиты после легочной инфекции VACV (69). Следовательно, в настоящее время мы не можем определить вклад перекрестной презентации в индукцию T CD8 + , специфичного для поздних VACV Ag.
Мы обнаружили, что один из исследованных Ag из гена B16R был иммуногенным, но не был представлен всеми VACV-инфицированными не-pAPC клетками.Об отсутствии презентации B16R 275–283 инфицированными клетками первоначально сообщили Moutaftsi et al. (15), в котором авторы использовали клеточную линию DC2.4 в качестве APC. Клетки DC2.4, однако, не являются репрезентативными для первичных DC, поскольку они допускают репликацию VACV и, таким образом, позволяют транскрипцию всех поздних генов. Мы нашли два экспериментальных условия, при которых могла произойти презентация B16R 275–283 . Как VACV-инфицированные DC, так и обработанные IFN-γ клеточные линии представили пептид B16R.Неясно, были ли механизмы, которые способствуют презентации пептида B16R, одинаковыми в линиях клеток, обработанных DC и IFN-γ. DC могут исключительно представлять некоторые вирусные пептиды, которые обычно не представлены другими типами инфицированных клеток (51), хотя механизмы, ответственные за это, остаются неопределенными. Известно, что обработка IFN-γ активирует множественные компоненты пути процессинга MHC-I, включая TAP и сам MHC-I. Однако ни MHC-I, ни TAP вряд ли будут ограничивать в этой системе.Таким образом, наше внимание было сосредоточено на иммунопротеасомах, в которых обработка IFN-γ способствует замене конститутивных субъединиц протеасомы на субъединицы LMP2, LMP7 и MECL-1, потенциально позволяя генерировать пептиды, которые не могут быть продуцированы при регулярной протеасомной деградации (48, 49). ). Однако мы не обнаружили роли иммунопротеасомы в IFN-γ-зависимой презентации пептида B16R 275–283 . Следовательно, другой компонент пути процессинга MHC-I, вероятно, является мишенью для IFN-γ и может предпочтительно экспрессироваться в DC.Одним из потенциальных компонентов является резидентный в ER шаперон тапазин, который очень чувствителен к IFN-γ и опосредует редактирование пептидов или загрузку комплекса MHC-I оптимальным пептидом внутри комплекса загрузки пептидов в ER (70).
Хотя B16R может быть представлен клетками, обработанными IFN-γ, вполне вероятно, что презентация инфицированными популяциями DC приводит к иммуногенности пептида B16R 275–283 по трем причинам. Во-первых, DC являются критическими APC в инициации ответа T CD8 + на VACV (23, 25, 26, 55).Во-вторых, VACV ограничивает количество IFN-γ рядом с инфицированными клетками, высвобождая продукт гена B8R, который представляет собой растворимый IFN-γ-связывающий белок (71). Хотя ген B8R усечен в штамме WR, используемом в этих исследованиях, он может влиять на реакцию Т-клеток на инфекцию VACV у естественного хозяина (72). В-третьих, иммунизация пептидом B16R 275–283 не смогла создать защитный иммунитет против интраназального заражения VACV. Это указывает на неспособность существующего эффектора или памяти T CD8 + распознавать VACV-инфицированные клетки для очистки.
Таким образом, наши данные демонстрируют, что иммуногенные пептиды, полученные из поздних VACV Ag, как непосредственно представлены инфицированными DC, так и перекрестно представлены in vivo. Однако не все ответы T CD8 + на поздние АГ являются защитными, вероятно, потому, что не-pAPC, которые являются основным резервуаром инфекции, не представляют релевантный p-MHC-I на поверхности клетки. Несмотря на это, поздние агенты представляют собой привлекательную мишень для вакцин, опосредованных CD8 + антипоксвирусом Т . Кроме того, использование поздних промоторов, которые активны в DC, для управления экспрессией неместных Ag в векторах на основе rVACV может вызывать как эффективный T CD8 + -опосредованный иммунитет, так и продуцировать достаточное количество белка для стимуляции выработки очень сильных ответов Ab. .
Раскрытие информации
У авторов нет финансового конфликта интересов.
Благодарности
Мы благодарим коллег доктора Тодда Шелла за клеточную линию bm1SV и доктора. Джон Юделл и Джек Беннинк из WR VACV, использованных в этих исследованиях. Мы благодарим Мелани Эплер, Дженнифер Меллингер, Трейси Кроуз и Ирен Рейдер за отличную техническую поддержку этих исследований. Мы также благодарим Нейта Шеффера (Nate Sheaffer) из основного центра проточной цитометрии Penn State Hershey Medical Center и Карен Брайар, Робин Гошорн, Жанетт Моль, доктораТиму Куперу и доктору Тиффани Уиткомбу за важную помощь животным и ветеринарную помощь. Мы также благодарим доктора Стефани Шелл за критический обзор рукописи.
Сноски
Эта работа была поддержана грантами AI070537, AI083008, AI097787, AI115230 и AI121876 Национального института аллергии и инфекционных заболеваний. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.
Сокращения, использованные в этой статье:
- AraC
- цитозинарабинозид
- DC
- дендритная клетка
- ECTV
- класс эктромелии I1177 MH I1111 MH 9117 9117 9117 9117 MH 9117 9117 инфекции
- pAPC
- профессиональный APC
- p-MHC-I
- комплекс пептид – MHC-I
- rVACV
- рекомбинантный VACV
- T CD4 +
- CD4 9038 +
- CD4 9038 клеток +
- CD4 9038
- CD8 + Т-клетки
- CD4 9038 клеток +
- VACV
- Вирус осповакцины
- WT
- дикого типа.
- Получено 16 сентября 2019 г.
- Принято 10 ноября 2019 г.
- Авторские права © 2019 Авторы
Использование противовирусной системы интерферона типа I в качестве первой линии защиты от SARS-CoV- 2 патогенность
Abstract
Возникновение и распространение коронавируса 2 (SARS-CoV-2) тяжелого острого респираторного синдрома привело к значительной глобальной заболеваемости, смертности и социальным потрясениям.Лучшее понимание взаимодействия вируса с хозяином может усилить терапевтические идеи по ограничению этой инфекции. Здесь мы исследовали динамику системного ответа на SARS-CoV-2 у хомяков с помощью гистологического анализа и транскрипционного профилирования. Инфекция привела к неизменно высокому уровню вируса в верхних и нижних дыхательных путях и спорадическому появлению в других дистальных тканях. Продольная когорта выявила волну воспаления, включая реакцию интерферона I типа (IFN-I), которая была очевидна во всех тканях независимо от присутствия вируса, но была недостаточной для предотвращения прогрессирования заболевания.Усиление противовирусного ответа интраназальным введением рекомбинантного IFN-I уменьшало вирусное заболевание, предотвращало передачу и уменьшало воспаление in vivo . Это исследование определяет системную реакцию хозяина на инфекцию SARS-CoV-2 и поддерживает использование интраназального IFN-I в качестве эффективного средства раннего лечения.
Ключевые слова: COVID-19, IFN-I, mRNA-seq, пандемия, хомяк, интраназальный, терапевтический, профилактический, цитокин, транскриптомика
Введение
Возникновение и глобальное распространение вируса никоим образом не является уникальным событие в записанной истории.Оспа, корь, вирус иммунодефицита человека и другие вирусные пандемии имели серьезные последствия для глобального здравоохранения и международной экономики ( Eisinger and Fauci, 2018 ). Четыре основных пандемии вируса гриппа А в прошлом веке и сезонные эпидемии привели к значительной заболеваемости и смертности ( Krammer et al., 2018 ). Бесчисленное количество возникающих и повторно появляющихся патогенов, включая вирусы денге, лихорадки Эбола, нипах и Зика, вызвали глобальные вспышки болезней по мере изменения климата и увеличения числа зоонозных случаев передачи.Как свидетельствует социальная нестабильность, вызванная тяжелым острым респираторным синдромом, вызванным коронавирусом 2 (SARS-CoV-2), мы по-прежнему недостаточно подготовлены к вспышкам этих заболеваний, несмотря на многие успехи биомедицинских исследований.
Все организмы способны реагировать на вирусную инфекцию. Противовирусная защита архей и бактерий на основе CRISPR работает за счет приобретения вирусного генетического материала хозяином, который затем используется в качестве матрицы для направления нуклеазы к другим копиям вирусного генома, вызывая его деградацию ( Barrangou et al., 2007 ). Точно так же у растений, членистоногих и червей белки Dicer перерабатывают двухцепочечную РНК вирусов в небольшие генетические фрагменты, которые позволяют РНК-индуцированному комплексу сайленсинга связывать и расщеплять вирус-специфические транскрипты ( Guo et al., 2019 ). В отличие от этих генетических защит, специфичных для последовательности, позвоночные используют относительно неспецифическую систему наблюдения за обнаружением патогенов в качестве защиты первой линии для подавления репликации вируса ( tenOever, 2016 ). У позвоночных клеточное распознавание вирусной инфекции достигает кульминации в индукции транскрипции семейства цитокинов, интерферонов типа I и III (IFN-I и IFN-III, соответственно), которые запускают каскад событий, которые в конечном итоге делают клетки менее восприимчивыми к вирусной инфекции ( Lazear et al., 2019 ; Mesev et al., 2019 ; Парк и Ивасаки, 2020 ).
Для индукции транскрипции IFNs требуется клеточное распознавание патогена посредством задействования рецепторов распознавания образов (PRR) ( Janeway and Medzhitov, 2002, ). Участие этих PRR приводит к активации двух семейств факторов транскрипции: ядерного фактора κB (NF-κB) и регуляторных факторов IFN (IRF) ( Maniatis et al., 1998, ).Совместная активация NF-κB и членов семейства IRF (IRF1, IRF3 и IRF7) вызывает транскрипционную активацию IFN-бета ( IFNB ), IFN-I, который затем транскрибируется, транслируется и секретируется, передавая сигналы в аутокринный и паракринный способ вызвать противовирусное состояние. Связывание IFN-I с его родственным рецептором на клеточной поверхности вызывает активацию комплекса факторов транскрипции, называемого IFN-стимулированным генным фактором 3 (ISGF3), состоящим из STAT1, STAT2 и IRF9 ( Stark et al., 2018 ).ISGF3 отвечает за усиленную экспрессию по крайней мере 150 генов, которые обладают прямым противовирусным действием ( Schneider et al., 2014, ; , , Schoggins and Rice, 2011, ). Этот ранний ответ IFN-1 ограничивает репликацию вируса и распространение от клетки к клетке и помогает координировать патоген-специфический адаптивный иммунный ответ и развитие иммунной памяти. Вирусы эволюционировали совместно, чтобы специфически блокировать ответ IFN-I именно из-за их критической роли в клиренсе вирусов ( García-Sastre, 2017 ).Это очевидно для всех вирусов, вызывающих значительную заболеваемость, включая оспу, корь, грипп, эпидемический паротит, краснуху и лихорадку Эбола. Действительно, SARS-CoV-2, этиологический агент пандемии коронавирусного заболевания 2019 (COVID-19), кодирует в своем геноме несколько антагонистов IFN-I ( Konno et al., 2020 ; Lei et al., 2020 ; Miorin et al., 2020 ; Thoms et al., 2020 ; Xia et al., 2020 ).Интересной особенностью инфекции SARS-CoV-2 является то, что вирус модулирует иммунный ответ таким образом, что подавляет систему IFN-I, но индуцирует и поддерживает высокие уровни мРНК хемокинов, что приводит к несбалансированному ответу хозяина ( Blanco-Melo et al. al., 2020 ; Qin et al., 2020 ; Zheng et al., 2020b ). Это сопоставление низкого уровня IFN-I и высокого уровня хемокинов может быть причиной усиленной инфильтрации нейтрофилов и моноцитов в дыхательные пути, что приводит к COVID-19 ( Coperchini et al., 2020 ; Zheng et al., 2020a ).
Здесь мы стремились всесторонне охарактеризовать реакцию хозяина на SARS-CoV-2, систематически отслеживая заболевание с момента первоначального контакта с вирусом, чтобы лучше понять биологию COVID-19. Инфекция SARS-CoV-2 вызвала волну воспаления, кульминацией которой стал системный ответ, охвативший дистальные органы, такие как мозг и желудочно-кишечный тракт. Патология легких после заражения SARS-CoV-2 у хомяков была аналогична той, что была описана у людей с COVID-19, и продемонстрировала стойкие транскрипционные изменения, которые продолжались даже после того, как вирус был очищен ( Carfì et al., 2020 ; Weerahandi et al., 2020 ). Наконец, интраназальное введение IFN-I снижает вирусную нагрузку и повреждение тканей, что позволяет предположить, что этот подход может быть эффективным ранним вмешательством при респираторном заболевании, вызванном SARS-CoV-2.
Результаты
SARS-CoV-2 вызывает несбалансированный противовирусный ответ
Чтобы оценить относительную реакцию хозяина на SARS-CoV-2, мы заразили золотых хомяков ( Mesocricetus auratus ) пандемическим вирусом гриппа A h2N1 (IAV) (A / California / 04/2009) или клинический изолят SARS-CoV-2 (USA-WA1 / 2020).Через пять дней после заражения все легкие собирали и анализировали секвенированием мРНК (mRNA-seq). Анализ главных компонентов продемонстрировал четкие и непротиворечивые транскрипционные сигнатуры между ложной инфекцией (PBS) и этими двумя респираторными вирусами ( А). Согласование захваченных считываний от каждого животного с геномами хозяина и вируса продемонстрировало сопоставимые вирусные нагрузки IAV и SARS-CoV-2 во время анализа, предполагая, что любые различия в ответе хозяина были вызваны биологией вируса (B). Чтобы идентифицировать уникальные аспекты ответа хозяина на SARS-CoV-2, мы идентифицировали дифференциально экспрессируемые гены (DEG), сравнивая когорты, инфицированные IAV и SARS-CoV-2, и оценили все гены хозяина с изменением в 2 раза больше, чем в 2 раза. для идентификации обогащенных биологических процессов (C; Таблица S1).SARS-CoV-2 индуцировал большую воспалительную сигнатуру, чем IAV, о чем свидетельствуют высокие уровни мРНК Ccl5 , Gzmb и Il1rn , что согласуется с тем, что наблюдалось у людей с COVID-19 и на модели хорька ( Blanco-Melo et al., 2020 ). Более того, экспрессия маркеров нейтрофилов Fcgr3 , Ccrl2 и Cf2 была значительно увеличена в ответ на инфицированных SARS-CoV-2 хомяков по сравнению с инфекцией IAV, что согласуется с данными аутопсий COVID-19 ( Таблица S1; Skendros et al., 2020 ).
Транскрипционные сигнатуры легких хомяков, инфицированных SARS-CoV-2 и IAV, различаются
(A) Анализ основных компонентов образцов мРНК-seq, полученных из всех легких хомяков (n = 4 / когорта), обработанных IN PBS , IAV (A / Cal / 04/2009) или SARS-CoV-2 (USA-WA1 / 2020), собранные через 5 дней после обработки и сопоставленные с эталонными геномами вируса и хомяка.
(B) Считывание на миллион SARS-CoV-2 и IAV из (A) относительно мРНК хозяина. Планки погрешностей указывают на стандартную ошибку среднего.
(C) График вулкана, сравнивающий DEG после SARS-CoV-2 по сравнению с инфекцией IAV, как описано в (A) (серый, не значительный; синий, значительный; красный, значительный и log2-кратное изменение> 2). Гены названы их человеческим ортологом.
См. Также таблицу S1.
При оценке этих данных также стало очевидно, что, как и многие иммунные гены, Ifnb1 не аннотирован в геноме золотого хомяка. Учитывая это, мы затем выполнили построение de novo на этих наборах данных mRNA-seq, а также поиск BLASTn консервативных геномных последовательностей Ifnb1 , общих для других грызунов.Мы идентифицировали транскрипт, который был на 85% похож на Ifnb1 на нуклеотидном уровне у китайского хомяка ( Cricetulus griseus ) (Рисунки S1A и S1B). На уровне белка этот транскрипт был более тесно связан с Ifnb1 из белоногой мыши ( Peromyscus leucopus ), показывая 65% совпадение идентичности (рисунок S1C). Чтобы убедиться, что этот ген функционирует, мы клонировали кДНК, экспрессировали ее в фибробластах золотистого хомячка (клетки BHK-21) и продемонстрировали, что трансфекция и перенос супернатанта приводят к устойчивой индукции генов, стимулированных IFN-хозяином (ISG), у хомяков. но не клеточные линии человеческого происхождения (Фигуры S1D и S1E).При сопоставлении транскрипта Mesocricetus auratus IFN beta 1 ( MaIfnb1 ) мы не обнаружили значительной индукции у животных, инфицированных SARS-CoV-2 или IAV (рисунок S1F). Эти данные предполагают, что SARS-CoV-2 индуцирует высокую экспрессию хемокинов в контексте приглушенного ответа IFN-I.
Инфекция SARS-CoV-2 может быть инициирована различными вирусными инокулятами и путями проникновения
Чтобы изучить, как разные пути заражения влияют на прогрессирование заболевания, мы подвергали неопытных хомяков зараженным SARS-CoV-2 фомитам, инфицированным животным или прямой посев через глаз или нос ( А).Во-первых, мы подтвердили, что наши вирусные запасы SARS-CoV-2 поддерживают сайт расщепления фурином в спайковом белке. Мутации в этом сайте, которые, как обычно было продемонстрировано, происходят во время пассирования в клетках Vero E6, были связаны с ослаблением in vivo ( Liu et al., 2020 ). Уровни SARS-CoV-2 у инфицированных хомяков первоначально измеряли с помощью qRT-PCR в реальном времени транскрипта субгеномного нуклеокапсида (N) (sgN) в нижних дыхательных путях. Передача фомита была наименее эффективным средством заражения, тогда как прямая инокуляция и контактная передача приводили к постоянному обнаружению вируса в легких на 4-й день после заражения (B).Более того, все пути передачи, включая глазную инфекцию, показали доказательства респираторного ответа хозяина с повышенными уровнями Isg15 и провоспалительного хемокинового хемокинового лиганда 11 ( Cxcl11 ) в легких (C и S2A).
SARS-CoV-2 инфицирует дыхательные пути и активирует врожденный иммунный ответ у хомяков
(A) Проверенные способы передачи: передача фомита через грязное гнездование из клетки инфицированного хомяка, прямой контакт с инфицированным хомяком, и прямой посев окулярно или ИН.
(B и C) Субгеномная РНК нуклеопротеидов (sgRNA) (sgN) и (C) Isg15 qRT-PCR в реальном времени РНК, экстрагированной из легких хомяка после воздействия вируса через фомиты в грязных клетках, прямой контакт с инфицированным хомяк, глазные капли (60000 БОЕ) или IN капли (1000 БОЕ) SARS-CoV-2, показанные как кратное изменение количества транскриптов по сравнению с неинфицированным контролем (n = 4; передача фомита, n = 3).
(D и E) sgN и (E) Isg15 qRT-PCR в реальном времени РНК, экстрагированной из легких хомяка через 2 дня после заражения 10, 100, 1000, 10000 или 100000 БОЕ SARS-CoV-2, показано как кратное изменение обилия транскриптов по сравнению с неинфицированными контролями (n = 4 для 10 и 1000 БОЕ, n = 6 для 100 БОЕ и n = 3 для 10000 и 100000 БОЕ).
(F) Вирусная нагрузка, определенная с помощью анализа бляшек из гомогенатов легких, полученных из ткани легких золотистых хомяков, инфицированных IN с помощью 1000 БОЕ, собранных через 4 дня после заражения и гомогенизированных в PBS (n = 12).
(G и H) sgN и (H) Isg15 qRT-PCR в реальном времени РНК, экстрагированной из гранулированного гомогената легких из (F), показано как кратное изменение количества транскриптов по сравнению с неинфицированным контролем.
Данные представлены в виде среднего значения, а полосы ошибок указывают стандартное отклонение.См. Также рисунок S2.
Учитывая способность точно контролировать инокулят и время заражения при интраназальном введении вируса, мы выбрали этот путь заражения для всех последующих экспериментов. В отличие от модели хорька, где требовалось 10 5 бляшкообразующих единиц (БОЕ) SARS-CoV-2 для инициирования реакции хозяина, которая ограничивалась верхними дыхательными путями ( Blanco-Melo et al., 2020 ), 10 БОЕ было достаточно, чтобы установить инфекцию нижних дыхательных путей у хомяков (D).Несмотря на индукцию аналогичного ответа хозяина, измеренного с помощью Isg15 и Irf7 , увеличение доз инокулята до 10 5 БОЕ не только не увеличивало общую репликацию, но, как правило, приводило к более низким уровням sgN и nsp14 ( D, 2E, S2B и S2C). Чтобы определить надежность интраназальной инфекции в этой модели беспородных животных, мы заразили 12 хомяков и обнаружили, что титры вируса в легких, измеренные с помощью анализа бляшек, стабильно составляли 10 6 БОЕ через 4 дня после заражения, с одним выбросом (F) .Воспроизводимость была дополнительно подтверждена с помощью qRT-PCR в реальном времени для sgN и сопутствующего ответа хозяина, измеренного с помощью мРНК Isg15 (G и 2H).
Прогрессирующая инфекция SARS-CoV-2 у хомяков приводит к патологии легких
Чтобы свести к минимуму любые мешающие факторы, которые могут возникнуть при нефизиологической вирусной нагрузке, мы оценили патологию легких в ответ на прививку 100 БОЕ. Легкие собирали на 2, 4, 6, 8 и 14 дни после заражения, и срезы тканей окрашивали антителом к вирусному N, гематоксилину и эозину (H&E) (A и 3B).Наиболее сильная экспрессия N-белка проявлялась через 4 дня после заражения и происходила преимущественно в эпителиальных клетках, составляющих воздушную границу легкого (A). Несмотря на то, что уровни N-белка резко снизились через 4 дня после заражения, вирусный белок все еще проявлялся через 14 дней, что согласуется с патологической оценкой срезов тканей, окрашенных H и E. В соответствии с более ранними сообщениями, были очевидны дегенерация эпителия в бронхиолах и альвеолярный некроз, а также гиперплазия пневмоцитов и цитопатия типа II, достигающие пика через 4 и 8 дней после заражения, соответственно (C; Imai et al., 2020 ). Также были доказательства альвеолярного, периваскулярного и бронхиального воспаления, пик которого достигался через 4-8 дней после заражения (D и S3A). Воспаление, определяемое совокупным гистопатологическим баллом, было максимальным на 8-й день после заражения (E; таблица S2). Более того, атипичная аденоматозная гиперплазия альвеол наблюдалась через 14 дней после инфицирования, даже после того, как большая часть воспаления утихла (B и S3B; Таблица S2). Дальнейший анализ окрашивания легочной ткани H&E на 3-й день после инфицирования выявил несколько отчетливых явлений.Мы наблюдали апоптоз в эпителии бронхов, а также гнездовые скопления нейтрофилов в бронхиолах инфицированных хомяков (F и 3G). Кроме того, наблюдался сильный отек сосудов даже в тех участках легких, где воспаление было относительно небольшим (H). Эти данные подчеркивают ценность этой модели небольших животных, в которой немодифицированный клинический штамм SARS-CoV-2 вызывает прогрессирующую инфекцию в нижних дыхательных путях, что в конечном итоге приводит к тяжелой пневмонии, наблюдаемой у людей с COVID-19.
Инфекция SARS-CoV-2 приводит к тяжелой патологии нижних дыхательных путей
(A и B) Репрезентативные изображения ткани легких золотистого хомяка, собранные через 2, 4, 6, 8 и 14 дней после заражения (100 БОЕ) и иммуногистохимические исследования с (A) N-специфическое антитело и (B) H&E (шкала, 50 мкм, n = 3).
(C и D) Средние значения гистопатологических баллов, оцененные сертифицированным патологом для каждого из наблюдений, соответствующие временным точкам в (A) и (B) (n = 3).Планки погрешностей указывают на стандартное отклонение.
(E) Совокупные клинические баллы по девяти различным гистопатологическим оценкам (Таблица S2). Каждая точка представляет собой оценку для одного животного.
(F и G) Репрезентативные изображения (F) апоптоза в эпителии бронхов (400-кратное увеличение), (G) накопления нейтрофилов (200-кратное увеличение) и (H) тяжелого отека сосудов (100-кратное увеличение) у хомяка легкие собраны через 3 дня после заражения SARS-CoV-2 (100 БОЕ).
См. Также рисунок S3 и таблицу S2.
Ответ хозяина IFN-I на инфекцию SARS-CoV-2 недостаточен для предотвращения распространения в нижние дыхательные пути
Затем мы исследовали транскрипционный ответ в дыхательных путях хомяков, инфицированных 100 или 10000 БОЕ, соответственно, в течение тот же курс, в течение которого мы наблюдали прогрессирующую патологию легких. Общую РНК из легких анализировали с помощью qRT-PCR в реальном времени на уровни sgN и Isg15 хозяина в указанные дни после заражения (фигуры S4A и S4B).В отличие от роста, плато и клиренса субгеномной репликации вируса, которые были максимальными между 2 и 4 днями после заражения после заражения 100 БОЕ, провокация 10000 БОЕ сразу же привела к высоким уровням РНК (рисунок S4A). За этим последовало общее снижение вирусных транскриптов на 6-й день после заражения (рисунок S4A). Кроме того, наблюдалось увеличение и снижение ответа хозяина на инфекцию инокулятом вируса с более низкой дозой, как измерено по уровням Isg15 , что отражало кинетику репликации вируса.Для инокулята вируса с более высокими дозами уровни Isg15 и оставались повышенными в течение 8 дней после заражения, после того как вирусная РНК была в значительной степени очищена (фигура S4B). Эти данные предполагают, что количество вирусного инокулята может влиять на реакцию хозяина на инфекцию и должно учитываться при анализе данных, экстраполированных на болезнь человека.
Чтобы дополнительно охарактеризовать полный противовирусный ответ на инфекцию, мы выполнили mRNA-seq в продольном исследовании и оценили уровни тщательно подобранного списка ISG в трахее и легких в указанные дни с теми же низкими и высокими дозами заражения вирусом ( A, 4B и S4C).Реакция хозяина на SARS-CoV-2 коррелировала с вирусной нагрузкой, определяемой по количеству считываний вирусов на миллион в трахее (A). Однако, несмотря на повышенную транскрипцию многих ISG, ответ хозяина был недостаточным для сдерживания репликации вируса в верхних дыхательных путях, что привело к высокой вирусной нагрузке в нижних дыхательных путях на 4-й день после заражения (B). Этот ответ на вирус был другим, когда вирусная нагрузка была увеличена на 2 порядка, когда мы не наблюдали задержки в продукции ISG в трахее или легких (A и 4B).Тем не менее, ответ хоста не смог ограничить распространение вируса. Эти данные также демонстрируют, что независимо от дозы инокулята инфекция SARS-CoV-2, по-видимому, ограничивает индукцию многих классических ISG, что согласуется с различными исследованиями ( Konno et al., 2020 ; Lei et al. , 2020 ; Lucas et al., 2020 ; Thoms et al., 2020 ; Miorin et al., 2020 ).
Транскрипционные сигнатуры IFN-I в верхних и нижних дыхательных путях
(A и B) Дифференциальная экспрессия генов из тщательно подобранного списка ISG, рассчитанная на основе совокупных последовательностей мРНК из (A) трахей и (B) легких хомяков, инфицированных SARS -CoV-2 для указанного времени и инокулята по сравнению с неинфицированным контролем.Тепловые карты представляют собой log2-кратное изменение каждого гена, указанного справа (человеческий ортолог), в моменты времени, указанные ниже. Средние значения чтения на миллион (об / мин), сопоставленные с геномом SARS-CoV-2 в обеих тканях на протяжении всего периода времени, показаны над каждой тепловой картой (коричневым цветом), а статистическая значимость обогащения списка генов в общем количестве DEG (зеленым цветом) показаны как -log10 (скорректированное значение p) (контрольная группа, n = 5; каждая экспериментальная группа, n = 3).
(C и D) Анализ обогащения генов всех DEG (log2-кратное изменение> 1, коэффициент ложного обнаружения [FDR] <0.05) увеличивалось во время инфицирования для (C) трахеи и (D) легких, как показано для динамики инфекции 100 БОЕ. Каждая точка указывает на статистически значимое представление категории генов, перечисленных слева в каждый момент времени. Размер точки указывает процент обогащенных генов из каждого набора аннотаций GO, а цвет представляет его FDR.
См. Также рисунок S4.
Помимо индукции ответа IFN-I, инфицированные клетки активируют другие программы транскрипции, направленные на снижение вирусной нагрузки.ДЭГ из трахеи и легких были обогащены транскриптами, участвующими в воспалительной реакции, которая включала рекрутирование адаптивной иммунной системы, как определено путем обогащения соответствующих аннотаций онтологии генов (GO) (C и 4D; Таблица S3). В трахее индукция генов, связанных с клеточной реакцией на вирус, стресс и цитокины, отражала уровни вируса, обычно достигая пика через 2–6 дней после заражения и затем рассеиваясь (C). Анализ обогащения генов показал значительные изменения в клеточном составе, что обозначено индукцией транскриптов, участвующих в сборке ресничек, формировании пучков микротрубочек и организации цитоскелета, что согласуется с окрашиванием H&E, что предполагает, что SARS-CoV-2 может вызывать потерю ресничек или ресничек. клетки (C и S4D).Подобные обогащенные генами пути наблюдались в инфицированных легких, хотя они, как правило, сохранялись в течение первых 8 дней прогрессирования заболевания (B и 4D). К 14 дню инфекция SARS-CoV-2 в трахее и легких разрешилась, что было измерено по отсутствию DEG за пределами регенерации ресничек (C и 4D; Таблица S3). Эти результаты описывают транскрипционный ответ на прогрессирование заболевания у хомяков, инфицированных SARS-CoV-2, и могут быть использованы в качестве ресурса для лучшего понимания молекулярной биологии, лежащей в основе противовирусного ответа у людей с COVID-19.
Воспаление в ответ на SARS-CoV-2 следует за инфекцией от верхних до нижних дыхательных путей
Инфекция SARS-CoV-2 способна нарушить аспекты биологии IFN-I, но также может привести к гипервоспалению ( Manson et al. ., 2020 ) Учитывая это, мы создали тщательно подобранный список воспалительных цитокинов и сравнили те же наборы данных транскрипции из нашего лонгитюдного исследования (A и 5B). В соответствии с нашими более ранними данными, инфекция, инициированная высокой дозой инокулята, привела к быстрой индукции воспалительных цитокинов хозяина, в отличие от ответа, сопровождающего провокацию с низким PFU.Кроме того, пик реакции хозяина в трахее предшествовал тому, который наблюдался в легких, примерно на 4 дня (A и 5B). Например, наиболее устойчивой индукцией генов-хозяев в ответ на SARS-CoV-2 были хемокины, которые отвечают за управление инфильтрацией иммунных клеток легких и респираторным расстройством, которое является отличительной чертой COVID-19 ( Tay et al., 2020 ; Vabret et al., 2020 ). В ответ на вирусное заражение 100 БОЕ уровни Ccl4 и Ccl5 достигли пика на 2-й день в трахее, в отличие от легких, где пиковые уровни не были достигнуты до 6-го дня (A, 5B и S5A). ).Сильная индукция этих хемокинов вместе с Cxcl10 и Cxc11 предполагала рекрутирование активированных Т-клеток и макрофагов в дыхательные пути. Это подтверждается наблюдаемым увеличением количества транскриптов Xcl2 , которые, вероятно, происходят из Т-клеток или естественных киллеров (NK) в ткани, в дополнение к повышенной экспрессии Cd8a , Cd4 и Cd3g (A, 5B , S5B и S5C). Кроме того, привлечение макрофагов предполагалось повышенной экспрессией Ccl2 , Ccl7 , Ccl8 и Itgam (фигура S5C).Кроме того, уровни экспрессии цитокинов и хемокинов не всегда были одинаковыми в верхних и нижних дыхательных путях. Например, Tnf и Il1b индуцировались до высоких уровней в верхних дыхательных путях, но обычно отсутствовали в нижних дыхательных путях. Напротив, Il36a , Cxcl6 и Ccl22 достигли более высоких уровней экспрессии в легких по сравнению с трахеей (A и 5B). Эти различия, вероятно, отражают гетерогенный состав этих тканей и различия в подмножествах иммунных клеток, которые были задействованы в этих участках, учитывая, что общие уровни вируса были сопоставимы в этих отделах дыхательных путей в разное время во время инфекции.
Профиль экспрессии хемокинов в верхних и нижних дыхательных путях у инфицированных золотых хомяков
(A и B) Дифференциальная экспрессия генов из тщательно подобранного списка хемокинов и цитокинов, рассчитанная на основе совокупных последовательностей мРНК из (A) трахеи и (B) ) легкие хомяков, инфицированных SARS-CoV-2, в указанное время и в указанных дозах по сравнению с неинфицированным контролем. Тепловые карты представляют собой log2-кратное изменение каждого гена, указанного справа (человеческий ортолог), в моменты времени, указанные ниже (контрольная группа, n = 5; каждая экспериментальная группа, n = 3).
(C и D) Среднее число оборотов в минуту от картирования РНК-seq до (C) Ifnb или (D) Ifnl в трахее через 1 день после инфицирования (n = 3).
(E) Средние титры антител IgG, специфичных к белку спайков, у хомяков в возрасте 9-10 недель и контрольной группы (n = 8), 7 (n = 11), 14 (n = 11) и 21 (n = 6) дни после заражения, измеренные с помощью ELISA и отображенные как площадь под кривой (AUC).
Планки погрешностей указывают стандартное отклонение. См. Также рисунок S5.
Согласование этих продольных данных РНК-seq с Ifnl и Ifnb1 показало, что при высокой дозе инокуляции вируса определяемые уровни обоих IFN присутствовали только в трахее через 1 день после заражения, без считывания любого транскрипта в легкие или любые другие ткани в любое время после заражения (C и 5D).По сравнению с профилем ISG, экспрессия цитокинов также снизилась к 14-му дню, что коррелировало с пиком антител иммуноглобулина G (IgG), специфичного к вирусному белку, что, как было ранее показано, вызывает защиту от повторного инфицирования (A, 5B и 5E). ; Imai et al., 2020 ; Tostanoski et al., 2020 ).
Инфекция SARS-CoV-2 вызывает системное воспаление в дистальных отделах тканей
Учитывая обширную репликацию вируса и последующую реакцию хозяина на инфекцию SARS-CoV-2, наблюдаемую у хомяков, мы затем исследовали ткани дистальнее дыхательных путей.В частности, мы исследовали инфекцию SARS-CoV-2 в обонятельной луковице, четырех долях мозга (лобной, теменной, височной и затылочной долях, которые здесь обозначаются просто как «мозг») и тонком кишечнике, но обнаружили противоречивые доказательства. репликации вируса, измеренной по количеству считываний вирусов на миллион, которые были на несколько порядков ниже, чем в дыхательных путях (и S6A). Однако, несмотря на низкие уровни считывания вирусов в тканях за пределами легких, сильный антивирусный транскрипционный ответ был очевиден, что измерялось по шкале обогащения для передачи сигналов IFN-I ( А – 6С).В ткани мозга доля ДЭГ была максимальной через 2 дня после инфицирования, что коррелировало с пиковой вирусной нагрузкой, наблюдаемой в верхних дыхательных путях (D и S6B). Гены, связанные с ответом на вирус, ответом на цитокины, передачей сигналов IFN и врожденным иммунитетом, появились до пика дифференциальной экспрессии генов в нижних дыхательных путях, что свидетельствует о том, что воспаление или, возможно, инфекция (вызванная распространением хемокинов или вирусом) распространяется в двух направлениях. из трахеи. Дополнительные генные сигнатуры в головном мозге включали сигнатуры, связанные с инициацией трансляции, нонсенс-опосредованным распадом и метаболизмом мРНК, предполагая отчетливый транскрипционный ответ, который в некоторых случаях сохранялся на протяжении всего эксперимента.В соответствии с доказательствами воспаления при отсутствии устойчивой инфекции, мы наблюдали наиболее устойчивый ответ IFN в обонятельной луковице (B, 6E и S6B). В дополнение к классическим ISG были очевидны генные сигнатуры для ответа на стресс и адаптивного иммунного ответа, которые могут объяснять острое обонятельное нарушение (аносмия), о котором сообщалось в легких и тяжелых случаях COVID-19 у людей и хомяков ( Cantuti-Castelvetri et al., 2020 ; Carignan et al., 2020 ; Imai et al., 2020 ). Самый умеренный воспалительный ответ в оцениваемых тканях был в тонком кишечнике, где наблюдалась слабая сигнатура антивирусного гена, которая коррелировала со временем пиковой вирусной нагрузки в дыхательных путях; подобная этиология была зарегистрирована у подгруппы людей с COVID-19 ( Ян и Ту, 2020 ).
Сайты, удаленные от прямой репликации SARS-CoV-2, демонстрируют значительное воспаление
(A – C) Статистическая значимость обогащения тщательно отобранного списка ISG среди общего числа DEG показана как –log10 (скорректированное значение p) над каждой временной точкой из анализа транскриптома общей РНК, экстрагированной из (A) мозга, (B) обонятельной луковицы или (C) тонкой кишки (все группы n = 3; тонкий кишечник 10000 БОЕ в день 8, n = 2) .
(D и E) Анализ обогащения генов всех DEG (log2-кратное изменение> 1, FDR <0,05), которые увеличились во время инфекции в (D) головном мозге, (E) обонятельной луковице и (F) в тонком кишечнике. изображен временной курс заражения 100 БОЕ. Каждая точка указывает на статистически значимое представление категории генов, перечисленных слева в каждый момент времени. Размер точки указывает процент обогащенных генов из каждого набора аннотаций GO, а цвет представляет его FDR (n = 3).
Уровни sgN(G), представленные в режиме реального времени с помощью qRT-PCR Ct, на 1 мкг РНК из обонятельной луковицы, головного мозга и тонкой кишки в указанные моменты времени после заражения 100 БОЕ SARS-CoV-2. Образцы РНК каждого органа и соответствующий момент времени были объединены перед анализом (n = 3 на условие). Красная пунктирная линия указывает значение Ct образца, соответствующего легким, взятому у хомяка через 4 дня после заражения.
Уровни(H) sgN, представленные с помощью qRT-PCR в реальном времени (-) Оценка Ct на 1 мкг РНК и БОЕ на 100 мг анализируемого гомогената ткани (n = 3 на условие).Горизонтальные полосы указывают среднее значение.
Поскольку многие из наблюдаемых транскрипционных сигнатур потребуют обнаружения молекулярных паттернов, связанных с патогенами (PAMP), мы затем провели более чувствительные анализы, чтобы определить, можно ли обнаружить низкие уровни репликации вируса, как сообщалось другими ( Imai et al. , 2020 ; Tostanoski et al., 2020 ). Мы подвергли ту же РНК из набора данных mRNA-seq к qRT-PCR в реальном времени для sgN. Используя этот анализ, мы смогли амплифицировать продукт ПЦР после менее чем 40 циклов в обонятельной луковице, головном мозге и тонком кишечнике на 1, 2 и 4 дни после заражения (G).Более того, транскрипты sgN могут быть обнаружены через 8 дней после заражения в обонятельной луковице, что позволяет предположить наличие реплицирующегося вируса, хотя и на 1/200 -го уровня легких через 4 дня после заражения. Чтобы подтвердить эти результаты, мы оценили каждую вышеупомянутую ткань на наличие инфекционных частиц с помощью анализа гомогената ткани на бляшках через 3 дня после заражения. Мы обнаружили, что уровни транскрипта sgN не всегда коррелировали с инфекционными частицами на уровне обнаружения, допускаемом анализом бляшек (H).Например, в обонятельной луковице ~ 400 БОЕ на 0,1 мг ткани были обнаружены только у одного животного, но sgN оставался неизменным при пороговом значении цикла (Ct) ~ 28 (H). Вместе с апоптозом, наблюдаемым в эпителии бронхов и отеком сосудов в легких инфицированных хомяков, эти данные позволяют предположить, что распространение вирусов PAMPs может быть ответственным за системное воспаление, наблюдаемое в тканях (F, 3H и). Для подтверждения этих результатов потребуются дальнейшие исследования, но если эти данные точно отражают несоответствие тканевого тропизма и воспаления у людей с COVID-19, то они могут указывать на основы различных клинических проявлений.
Интраназальное введение IFN-I ограничивает репликацию вируса и воспаление
Повышенные ISG, наблюдаемые во всех исследованных тканях, могут отражать способность IFN-I ограничивать тропизм тканей. Чтобы определить, может ли IFN-I оказывать профилактическое действие против COVID-19, мы решили протестировать его интраназально на нашей модели хомяка. Сначала мы оценили бета-IFN мыши и человека вместе с коммерчески доступным универсальным IFN (IFNα A / D) в линии клеток хомяка BHK-21 и обнаружили, что IFNα A / D является наиболее эффективным (рис. S7A).Чтобы изучить противовирусную эффективность in vivo , мы вводили IFNα A / D хомякам интраназально и оценивали транскрипционный ответ в дыхательных путях с помощью mRNA-seq и дополнительно подтвердили эти данные с помощью qRT-PCR в реальном времени ( A и S7B). Был индуцирован устойчивый ответ IFN-I, состоящий из канонических ISG, включая Isg15 , Mx1-2 , Ifit2-3 , Cxcl10-11 и Oas1-3 , среди других (Таблица S4) . Чтобы убедиться, что этот ответ был достаточным для значительного снижения вирусной нагрузки in vivo , мы провоцировали хомяков SARS-CoV-2 через 24 часа после интраназального (IN) введения PBS или IFNα A / D и продолжали ежедневное лечение IN в течение инфекция.Мы оценили вирусную нагрузку у животных, получавших IFNα A / D и PBS, по результатам анализа бляшек через 48 часов после заражения вирусом (B). Вирусная нагрузка была снижена у хомяков, получавших IFNα A / D, с логическим уменьшением инфекционных вирионов, что также отражалось на уровнях sgN РНК (C). В дополнение к логарифмическому снижению вирусной нагрузки профилактический IFNα A / D также снижал уровни мРНК Cxcl11 и Il6 в легких (D и 7E). Кроме того, мы выполнили иммуногистохимию (ИГХ) для белка SARS-CoV-2 N и MxA в легких через 3 дня после заражения, которые обрабатывали ИН PBS или IFNα A / D ежедневно, начиная с 24 ч до заражения, и количественно определяли экспрессию белка (см. STAR методы для деталей; F и 7G).Экспрессия белков N и MxA была значительно снижена. Это не только подтвердило снижение вирусной нагрузки у хомяков, получавших ИН с помощью IFNα A / D, но также предположило, что введение IFN-I может в конечном итоге снизить величину врожденного иммунного ответа в модели золотого хомяка. Кроме того, эти легкие также были окрашены H&E, что выявило меньшее воспаление у хомяков, получавших IFNα A / D (H и S7C).
Введение IFN снижает вирусную нагрузку и патологию легких у хомяков
(A) График вулкана, показывающий DEG из анализа транскриптома РНК, экстрагированной из легких золотистых хомяков, получавших 200000 единиц IN IFNα A / D в течение 8 часов по сравнению с имитацией лечения .Каждая точка представляет ген, построенный по его log2-кратному изменению по оси x и статистической значимости по оси y как -log10 (значение p) (n = 3 для каждого условия). Все гены с log2-кратным изменением более 4 и значением p менее 0,05 помечены именем ортолога человека.
(B) Анализ бляшек гомогената легких из легких золотистого хомячка, инфицированных 100 БОЕ SARS-CoV-2, собранных через 2 дня после заражения после ежедневной обработки IN PBS или 200 000 единиц IFNα A / D за 24 часа до инфицирования.n = 10 на условие из двух независимых экспериментов, p = 0,007.
(C) относительные уровни экспрессии sgN с помощью qRT-PCR в реальном времени из легких хомяков, инфицированных 100 БОЕ SARS-CoV-2 и обработанных ИН, за 24 часа до инфицирования PBS или IFNα A / D и собранных через 3 дня после инфекционное заболевание. n = 10 на условие из двух независимых экспериментов, p = 0,0007.
(D) qRT-PCR в реальном времени для кратной индукции мРНК Cxcl11 из соответствующих легких хомяка по сравнению с легкими хомячка с ложной инфекцией (n = 3).n = 10 из двух независимых экспериментов, p = 0,0039.
(E) qRT-PCR в реальном времени для кратной индукции мРНК Il6 из соответствующих легких хомяка по сравнению с легкими хомячка с ложной инфекцией (n = 3). n = 10 на условие из двух независимых экспериментов, p = 0,0476.
(F) Репрезентативные изображения иммуногистохимического окрашивания N-специфическим антителом и MxA в легких через 3 дня после инфицирования IN PBS или IFNα A / D, вводимых за 24 часа до инфицирования. Шкала N-белка, 2.5 мм; Масштабная линейка MxA, 1 мм.
(G) Количественная оценка экспрессии белка с использованием ColorDeconvolution2 в ImageJ (подробности см. В методах STAR). Для N-белка n = 8 общих репрезентативных изображений от 2 животных на группу обработки, p = 0,0011; для MxA n = 12 полных репрезентативных изображений от 3 животных на группу лечения, p = 0,0081.
(H) Репрезентативные изображения пятен H&E из перфузированных легких хомяка, полученные через 3 дня после заражения 100 БОЕ SARS-CoV-2 и ежедневного лечения IN PBS или 200000 единиц IFNα A / D.Шкала 100 мкм. Репрезентативное изображение IFNα A / D представляет собой легкое, в котором соответствующие уровни sgN были снижены на log по сравнению с контролями, инфицированными PBS и SARS-CoV-2.
(I и J) Анализ зубного налета и (J) qRT-PCR в реальном времени для Il10 гомогенатов легких золотистых хомячков, инфицированных 100 БОЕ SARS-CoV-2 и обработанных IN, начиная с 24 ч после заражения PBS или IFNα A / D собирали через 3 дня после заражения. n = 10 на группу лечения из 2 независимых экспериментов. р = 0.0186 (I) и p = 0,0213 (J).
(K) qRT-PCR в реальном времени для sgM и sgN из легких хомяков, инфицированных SARS-CoV-2, впоследствии ежедневно обрабатываемых IN PBS или IFNα A / D и собираемых через 6 дней после заражения, n = 4 на лечебная группа; sgM, p = 0,0137; sgN, p = 0,0237.
(L) qRT-PCR в реальном времени для Il6 из легких хомяков, инфицированных SARS-CoV-2, впоследствии ежедневно обрабатываемых IN PBS или IFNα A / D и собираемых через 6 дней после заражения, представленных как кратная индукция превышение исходного уровня экспрессии у ложно инфицированных золотых хомяков; n = 4 на группу лечения.
(M) Репрезентативные изображения пятен H&E инфильтратов из легких хомяков, инфицированных SARS-CoV-2, впоследствии ежедневно обрабатываемых IN PBS или IFNα A / D и собранных через 6 дней после заражения; Увеличение 400 ×.
«Neu» и «Mac» обозначают нейтрофил или макрофаг соответственно. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение. См. Методы STAR для используемых статистических тестов.
Чтобы определить, может ли IN IFNα A / D обеспечить терапевтический эффект для улучшения исхода заболевания в этой модели, мы лечили животных IFNα A / D ежедневно, начиная через 24 часа после заражения SARS-CoV-2, и собирали легкие 3. и через 6 дней после заражения.Через три дня после инфицирования в IFNα A / D- было меньше инфекционных вирионов по сравнению с легкими, обработанными PBS, в дополнение к повышенным уровням противовоспалительного цитокина интерлейкина-10 ( Il10 ) (I и 7J). Через шесть дней после заражения инфекционные вирионы в легких ни в одной из экспериментальных групп отсутствовали, как измерено с помощью анализа бляшек, но было меньше вирусной РНК sgN и субгеномной мембраны (sgM), а также более низкие уровни мРНК Il6 (K и 7L). ). Кроме того, анализ окрашивания легких H&E через 6 дней после инфицирования показал, что легкие, терапевтически обработанные IFNα A / D, имели инфильтрат иммунных клеток, состоящий в большей степени из реактивных макрофагов и меньшего количества нейтрофилов по сравнению с их контролем; повышенный митоз также наблюдался в бронхиальном эпителии, предполагая, что эти хомяки были ближе к разрешению болезни (M).В сочетании с повышенной экспрессией Il10 на 3-й день и сниженной экспрессией интерлейкина-6 на 6-й день эти данные предполагают, что введение экзогенного IN IFN-I приводит к модифицированному инфильтрату иммунных клеток, что приводит к более низкой вирусной нагрузке.
Для дальнейшего выяснения профилактической ценности IFNα A / D мы применили его к более клинически значимой модели передачи, в которой обработанные животные подвергались прямому контакту, а не заражались ИН. Животных обрабатывали PBS или IFNα A / D и помещали в клетки вместе с инфицированными животными в течение 10 часов (фигура S7E).В соответствии с нашей моделью прямого заражения, IFNα A / D, вводимый профилактически в этой модели передачи, привел к более чем 2-логарифмическому снижению вирусных титров у инфицированных животных и предотвратил передачу в целом у 3 из 5 животных (рисунок S7E). Последние результаты были дополнительно подтверждены ИГХ белков MxA и N, показав, что IFNα A / D-опосредованная индукция ISG и ограниченная вирусная экспрессия (фигуры S7F и S7G). Это было проиллюстрировано тем фактом, что перекрывающиеся низкие уровни MxA с N-белком присутствовали у животных, получавших PBS, но отсутствовали у обработанных IFNα A / D хомяков (где MxA преобладал в отсутствие окрашивания N) (F и 7G).Эти данные могут быть дополнительно подтверждены путем измерения уровней мРНК sgN в легких (рисунок S7H).
Поскольку лечение IFN-I может быть запретительным по различным экономическим и географическим причинам, мы затем исследовали, можно ли достичь сопоставимого противовирусного ответа при введении IN PAMP, который будет индуцировать эндогенный IFN-I. Преимущества использования PAMP, такого как миметик для двухцепочечной РНК (дцРНК) (поли (I: C)), включают простоту производства и хранения, а также доступность.Введение IN поли (I: C) показало противовирусную активность, сравнимую с IFNα A / D (фигура S7I).
Обсуждение
В ответ на пандемию COVID-19 были предприняты беспрецедентные усилия по разработке терапевтических вмешательств в сфере вакцин и противовирусных препаратов. Для нацеливания на вирус SARS-CoV-2 использовались различные стратегии, включая прямое ингибирование репликации вируса путем воздействия на РНК-зависимую РНК-полимеразу, протеазу и S-белок и / или блокирование взаимодействий с рецептором входа ACE2 и TMPRSS2 в сочетании с дальнейшее определение сложности этих взаимодействий ( Dieterle et al., 2020 ; Douangamath et al., 2020 ; Han et al., 2020 ; Сорокина и др., 2020 ; Tay et al., 2020 ). Кроме того, предпринимаются усилия по перепрофилированию одобренных Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA) лекарств, которые могут иметь терапевтическую ценность in vivo ( De Clercq and Li, 2016 ; Si et al., 2020 ). Чтобы разработать общие меры противодействия вирусным вспышкам, наша стратегия заключалась в разработке антивирусных агентов широкого спектра действия, а не вмешательств, специфичных для патогенов, для каждой новой и вновь возникающей глобальной вирусной вспышки.Наш подход фокусируется на использовании реакции хозяина для борьбы с вирусными инфекциями; а именно усиление ответа IFN-I.
Мы обнаружили, что реакция хозяина на SARS-CoV-2 у хомяков, хотя и недостаточна для защиты от тяжелой бронхопневмонии, индуцированной вирусом, характеризуется активной передачей сигналов IFN-I. В других исследованиях был выявлен аналогичный транскрипционный ответ у мышей, трансгенных по ACE2 (hACE2) человека, и у мышей, трансдуцированных векторами на основе аденовируса, кодирующими hACE2, или с использованием адаптированного к мышам штамма SARS-CoV-2 ( Dinnon et al., 2020 ; Israelow et al., 2020 ; Sun et al., 2020 ; Winkler et al., 2020 ). Кроме того, мы можем показать, что этот ответ распространяется за пределы дыхательных путей в нескольких органах, удаленных от места инфекции, на срок до 14 дней. Хотя было высказано предположение, что несбалансированный IFN-I частично ответственен за тяжелое воспаление и аберрантную инфильтрацию нейтрофилов, IFN-I также необходим для контроля титров вирусов у хомяков и мышей ( Boudewijns et al., 2020 ; Sun et al., 2020 ). Учитывая этот эффект ответа IFN-I на ограничение репликации вируса, мы решили использовать рекомбинантный IFN-I в качестве профилактического и терапевтического средства против SARS-CoV-2. IFN-I и / или IFN-III являются идеальными кандидатами для подавления вирусной инфекции. В дополнение к их плейотропным эффектам в прямом воздействии на несколько стадий цикла репликации вируса, IFN также активируют соответствующий иммунный ответ для удаления вируса, независимо от патогена ( Wang and Fish, 2019 ).Недавно было продемонстрировано, что передача сигналов IFN-I, опосредованная STAT2, может ограничивать репликацию и распространение вируса в модели хомяка, тогда как передача сигналов IFN-III оказалась менее важной. Кроме того, клинически было продемонстрировано, что наличие аутоантител против IFN и врожденные ошибки врожденного иммунитета, такие как дефицит TLR3 и IRF7, повышаются у людей с тяжелой пневмонией COVID-19, что указывает на потенциальную ценность экзогенного IFN. лечение некоторых лиц, чей собственный ответ на IFN нарушен или затруднен ( Bastard et al., 2020 ; Zhang et al., 2020 ). Тем не менее, системное введение IFN-I, как оказалось, имеет очень низкую согласованность, поскольку может вызвать нежелательные побочные эффекты. Эта динамика, вероятно, способствовала неспособности IFN-I снизить смертность в испытании солидарности для лечения COVID-19 (СОЛИДАРНОСТЬ) ( Dinnon et al., 2020 ; Pan et al., 2020 ). Чтобы избежать этих потенциальных побочных эффектов, мы вводили IFN-I локально в дыхательные пути и добились снижения вирусной нагрузки на 2-3 log и удерживали вирус ниже предела обнаружения в определенных экспериментальных условиях.Кроме того, недавнее клиническое испытание фазы 2 ингаляционного, распыленного IFN beta-1a для лечения людей с COVID-19 привело к сокращению времени до выздоровления ( Monk et al., 2020 ). Это поддерживает IN доставку IFN-I в качестве потенциального профилактического и терапевтического средства против COVID-19.
Результаты SARS-CoV-2 неоднородны, причем наибольшая дихотомия наблюдается между молодыми людьми и людьми пожилого возраста ( Williamson et al., 2020 ). Хотя это несоответствие, безусловно, имеет несколько основных факторов, многочисленные сообщения указывают на то, что пропуск противовирусного ответа является основным фактором тяжести заболевания ( Blanco-Melo et al., 2020 ; Hadjadj et al., 2020 ; Lucas et al., 2020 ; Yao et al., 2020 ). Как наблюдали в культуре клеток и на моделях животных, ясно, что реакция хозяина на SARS-CoV-2 приводит к раннему аберрантному ответу IFN, сочетающемуся с избыточной продукцией хемокинов ( Blanco-Melo et al., 2020 ; Hadjadj et al., 2020 ; Lucas et al., 2020 ). В модели хомяка инфекция SARS-CoV-2 приводит к индукции недостаточного ответа IFN-I, поскольку он распространяется из верхних дыхательных путей в нижние.Хотя остается неясным, предотвращает ли повышенный иммунитет этих тканей вирусную инфекцию и, следовательно, ограничивает ли тропизм в этой модели хомяка, это согласуется с тем фактом, что недыхательные органы, экспрессирующие ACE2, часто показывают отсутствие вируса даже при тяжелой форме COVID. -19 случаев ( Ziegler et al., 2020 ). В любом случае сочетание высоких провоспалительных цитокинов и хемокинов и низких уровней IFN-I, вероятно, является молекулярной основой гнезд нейтрофилов, наблюдаемых в нижних дыхательных путях.Этот вывод подтверждается тем фактом, что экзогенное введение IFNα A / D снижает присутствие нейтрофилов в легких.
Мы также наблюдали, что воспалительный ответ, инициированный в самом раннем месте репликации, верхних дыхательных путях, может быть достаточным для индукции системного воспаления в дистальных тканях, где зрелые вирионы присутствуют на исчезающе низких уровнях, если вообще присутствуют, несмотря на надежное обнаружение вирусная РНК. Однако были сообщения об инвазии центральной нервной системы у умерших людей, положительных по ПЦР SARS-CoV-2 ( Meinhardt et al., 2020 ). Хотя источник воспалительной реакции в этих дистальных тканях остается неясным и различается ли источник воспаления между случаями легкого, умеренного и тяжелого заболевания, есть соблазн предположить, что секреция или распространение субгеномного материала из-за его обилия, возможно, связанный с белком N с образованием защищенного рибонуклеопротеидного комплекса, может быть преобладающим PAMP, который распространяется из первичного сайта репликации. В поддержку этой идеи мы обнаружили, что обнаружение sgN с помощью qRT-PCR в реальном времени не всегда коррелирует с обнаружением инфекционных вирионов.Эта концепция требует дальнейшего изучения, но была предложена в прошлом для неродственных РНК-вирусов ( tenOever et al., 2002, , , , , 2004, ).
Здесь мы представляем убедительные доказательства того, что введение ИН или индукция IFN-I обеспечивает защиту от инфекции SARS-CoV-2, будь то для профилактики или для раннего терапевтического использования. Эти данные отражают ингибирующий потенциал IFN-I и указывают на возможность введения IN IFN в качестве противовирусных агентов широкого спектра действия для SARS-CoV-2 и потенциально других респираторных вирусных инфекций.
Ограничения исследования
Транскрипционный ответ хозяина во время раннего заражения SARS-CoV-2 и после удаления вируса остается в значительной степени неопределенным, частично из-за ограничений в клинических условиях. Здесь мы определяем эту реакцию у молодых золотых хомяков, которые способны эффективно избавляться от вируса после развития болезни. Это имеет свои ограничения, в том числе отсутствие изображения старых животных и экстраполяцию на человеческие болезни. Возраст животных и тяжесть заболевания могут изменять противовирусный ответ хозяина и / или тканевой тропизм вируса.Роль IFN-I в течении заболевания COVID-19 широко обсуждалась, но клинические испытания его внутривенного введения оказались многообещающими. Это исследование определяет раннее лечение COVID-19.